梨抗黑星病突变体离体筛选研究论文.pdfVIP

梨抗黑星病突变体离体筛选研究 徐凌飞 赵骇博 马锋旺 梁 东 符轩畅 (西北农林科技大学园艺学院，陕西杨凌 712100) 摘 要：以国内梨主栽品种砀山酥梨为材料，以叶片为外植体，以梨黑星病病原茵 粗毒素作为选择剂，利用组织培养技术，采用一步筛选法和多步筛选法，进行梨抗 黑星病突变体离体筛选研究。结果表明：砀山酥梨叶片及其产生的愈伤组织忍耐的 最大粗毒素浓度为50％，且粗毒素对叶片愈伤组织的诱导及分化有显著的抑制作 用，随着粗毒素浓度的上升，抑制作用增强。通过叶片接种毒素试验鉴定，发现筛 选株系耐病性明显高于对照，说明筛选株系有抗病性。 关键词：梨；梨黑星病菌；毒素；抗病突变体 梨黑星病(Venturianashicola)是梨树的主要真菌性病害之一，在各梨区普遍发生， 每年造成不同程度的损失，流行年份尤其惨重[1]。目前防治梨黑星病主要依靠化学药物，易 造成环境污染，危害人类健康，加之该病为害期长，在整个生长季节只要条件适宜，均可侵 染发病，给防治带来困难。发掘和创制新的抗源，选育抗病品种已成为有效控制梨黑星病的 重要途径。 植物离体培养筛选细胞突变体技术迅速发展，为植物遗传改良开辟了一条新的途径。目前国内 外已在一些植物上建立了较为完善的利用组织培养技术离体筛选抗逆种质的新方法。在抗病， 抗除草剂、耐盐胁迫、抗金属离子和改良品质育种方面都取得了可喜的成就，获得了大量的突 变体材料[3~5]。然而，在应用毒素或菌液离体筛选培养果树抗病突变体的研究方面相当薄弱， 目前尚未见到利用致病毒素和离体培养技术筛选有关梨树抗黑星病突变体的报道。因此，本研 究拟在建立和完善梨抗黑星病体细胞变异无性系诱导筛选体系的基础上，获得抗黑星病的体细 胞变异株系，这对于加速梨抗黑星病新品种的培育和推广，改变目前梨树生产上黑星病为害的 严重局面，降低生产成本，减少农药污染，促进无公害果品生产有重要意义。 l材料与方法 1．1材料 以砀山酥梨试管苗叶片为外植体；供试梨黑星病病原菌为本实验室保存。 1．2梨黑星菌粗毒素的提取 纯化的菌株接种于PDA平板上，于25℃、黑暗培养14d后，沿菌落边缘打出直径为 8mm的菌块，接入装有250ml 黑暗条件下振荡培养21d。然后用定性滤纸过滤菌培养液，4 梨抗黑星病突变体离体筛选研究 525 纤维素膜过滤即得粗毒素。 1．3梨黑星病病原菌粗毒素对砀山酥梨叶片愈伤组织诱导分化的影响 切取继代培养30～40d的砀山酥梨试管苗中上部充分展开的幼嫩叶片，去掉叶柄，垂直 叶片中脉横切伤三刀，远轴面向下，接种在粗毒素体积分数分别为10％、20％、30％、 40％、50％和60％的筛选培养基上。每处理50个外植体，接种时外植体伤口与培养基表面 0001x，光周期 状况。离体叶片在暗培养20d后，转至培养条件为：温度20～25℃，光照2 13h，培养30d后，统计各处理的不定芽分化率及不定芽生长状况。 1．4抗性细胞系的筛选 2．5mg／I。+IBA 30％、40％或50％浓度的粗毒素液，一次诱导分化出植株。 (2)一步筛选法(愈伤组织筛选)：先在砀山酥梨叶片再生培养基上诱导出愈伤组织， 然后挑选一批质地均匀的愈伤组织，转接至NN69+6一BA2．5mg／L+IBA0．3mg／L-+-山梨 醇209／L+琼脂89／L+40％粗毒素液的培养基上继代一次后分化植株。 (3)多步筛选法(离体叶片直接筛选)：将在附加10％粗毒素液的叶片再生培养基诱导 出的抗(耐)毒素细胞系，转至附加有10％粗毒素液的叶片再生培养基上继代，25d后，将 存活的愈伤组织的一部分继续在附加有20％毒素的培养基上继代，另一部分用于分化植株； 25d后，又将存活的愈伤组织的一部分继续在附加有30％毒素的培养基上继代，另一部分用 于分化植株；25d后，再将存活的愈伤组织的一部分继续在附加有40％毒素的培养基上继 代，另一部分用于分化植株。25d后，再将存活的愈伤组织的一部分继续在附加有50％毒素 的培养基上继代，另一部分用于分化植株。 (4)多步筛选法(愈伤组织筛选)：先在无毒素叶片再生培养基上诱导出愈伤组织，然 分化植株，方法同多步筛选法(离体叶片直