邻苯二甲酸二丁酯(DBP)单克隆抗体的制备及酶联免疫检测试剂盒研究论文.pdfVIP

邻苯二甲酸二丁酯(DBP)单克隆抗体的制备 及酶联免疫检测试剂盒研究 时国庆，刘杰民，栗时锋，孙清，曹宇，高永杰，章众 (北京科技大学化学与生物工程学院，北京，100083；§hig业ging@丛§!坠：曼鱼坠：鱼n2 关键词：邻苯二甲酸二丁酯单克隆抗体ELISA 1．研究背景 邻苯二甲酸二丁酯(DBP)是使用量非常大的酞酸酯类化合物之一，其残留广泛 存在于环境与食品中。研究报告显示，低剂量的酞酸酯类化合物可干扰生物体正常的 生殖和发育。目前缺少快速简便检测酞酸酯类化合物免疫分析技术。我们在成功制备 的DBP单克隆抗体基础上，通过优化试剂盒制备参数和样品前处理条件，制备了DBP 快速酶联免疫检测试剂盒。 2．结果与讨论 2．1．DBP人工抗原的制备 采用重氮化方法将DBP特征结构与载体蛋白BSA结合(图1a)，人工抗原吸收 峰在330nm一400nm有明显光吸收(图lb)，这是由于偶联后形成共轭大兀键。根据郎 伯一比尔公式计算得DBP在载体蛋白上得偶联率为13：1。 № 湖 枷5∞ ^『nm 图l、DBP--BSA人工抗原合成路线及鉴定 2．2．DBP单克隆抗体的制备与鉴定 经免疫、细胞融合、细胞克隆、亚克隆，筛选得到一株高分泌细胞株1D2，抗体 7。 体亲和常数为6．26×lO 2．3．ELISA方法的建立与标准曲线 通过优化包被抗原浓度、DBP抗体及HRP标记羊抗鼠抗体浓度，及封闭液、酶 标板保护液、样品稀释液组成，建立了ELISA检测方法。其标准曲线如图2所示。 2．4．ELISA试剂盒各项技术参数 ／mL，板内和板间变异系数(C．V)均小于5％。试剂盒对邻苯二甲酸二异丁酯(DIBP) 的交叉反应率为19．9％，对邻苯二甲酸丁苄酯(BBP)的交叉反应率为9．1％，对邻苯 二甲酸二异辛酯(DEHP)的交叉反应率0．1％，对食品中常见的8种对羟基苯甲酸酯 类化合物的交叉反应率均1％。对于瓶装水、瓶装饮料、白酒、牛奶等不同样本中DBP 的添加回收率在76．9—110．4％之间，变异系数在3．29．14．8％之间，对实际样品中DBP 的检出限为0．027pg／mL。保存实验显示，试剂盒在37。c存放9天后，4。c存放6个 月后其阴性OD值下降小于20％，IC50值未见明显变化。 ≮ 7 m 、 ¨舻 I| ∞懈 、、 鼙 yⅥ19041州x1．170．26＼ R2=099221 搴。鼍t 卅厂每／自 一。 ●， ||l∥ 》萨 仰∞舳邗∞∞帅如功m ?／ o lI， 100 1000 10000 ¨tl·： L L：， ￡ fmgjKg) DBPConc．(ng／mL)DBPCOLIC·byltPLC—MS／MS 图2、DBP酶联免疫检测方法标准曲线图3、试剂盒检测结果与HPLC--MS／MS检测结果的对比 2．5．试剂盒的对比测试 从市场上随机购买了19个白酒样品，分别用本试剂盒和HPLC—MS／MS方法对 其中的DBP残留进行检测，对两种检测方法得到的检测结果进行比对。结果表明，试 剂盒检测结果