牛分枝杆菌Spoligotyping和VNTR-MIRU的基因分型研究论文.pdfVIP

杜艳芬，林靖凯，刘思国，王春来，刘慧芳，司微，王聃，赵海玲 (中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室细菌病研究室哈尔滨150001) 【摘要】为了探讨间隔区寡核苷酸分型(Spacer numbertandem 复单元(variable repeats—mycobacterialinterspersedrepetitive 因分型研究，初步了解我国牛分枝杆菌基因型种类、分布以及2种方法在我国应用的可行性，本研究收集东北、西北、华北、华 高牛结核病的分子流行病学调查和病原学的监测效果。 【关键词】牛分枝杆菌；Spoligotyping；VNTB；MIRU；基因分型 牛结核病(Bovinetuberculosis)是由牛分枝杆菌不同牛场的牛分枝杆菌进行了分子分型分析。 (mycobaetedumhovm)和结核分枝杆菌(myeohactetium 1材料和方法 tuberculosis)所引起的严重危害养牛业和公共卫生安 全的一种人畜共患的慢性、消耗性传染病”1。其宿主 1．1 茵株 谱广泛，可以感染几乎所有的温血脊椎动物和20多种 来自全国不同地区分离的10株牛分枝杆菌。参考 禽类。 菌株H37Rv购于中国药品生物制品检定所，彪肋谪 传统的牛分枝杆菌的分类鉴定主要是以形态和理 BCG由本实验室保存。 化特征为依据的表型分类法，其耗用时间较长，一般 1．2主要试剂和仪器 需要2．3个月。由于结核病具有潜伏感染的特点，传统 DNA 十二烷基磺酸钠(SDS)为上海生工产品；pfu 的流行病学方法不能很好地揭示其传播规律，以结核 Mini—blotter Life 分枝杆菌基因分型技术为基础的分子流行病学在这方 Science／公司产品； MN45为荷兰Isogen 面有着不可替代的优势。 Applied 目前，基因分型技术已经成为结核病分子流行病 学研究中的重要方法。其中以插入序歹tJIS6110限制性 片段长度多态分析(IS6110一RFLP)被公认为基因分Bioscience公司。 型的“金标准”。但由于该方法需要培养大量细菌、实 1．3细茵基因组DNA提：取 验操作繁琐、实验室间的结果难以进行比较，尤其是 结核分枝杆菌基因组DNA的提取参考vali 对IS61 10低拷贝菌株难以进行基因水平的鉴定等诸多 Soolingen等1的方法略加改进。 缺点，限制了该方法的应用和普及。因此一些以PCR 1．4 Spohgotyping 为基础的DNA指纹技术以其快速、简便、分辨率高的 特点而备受关注。其中使用最为广泛的有间隔区寡核 苷酸分型(Spoligotyp-ing)、数目可变串联重复序列以及 number 结核分枝杆菌散在分布重复单元(variable tandem repeats-mycobacterialinterspersedrepetitiveunit， 2× 个循环。(2)PCR产物的杂交与检测：用250mL VNTR—MIRU)分型法。为此，我们采用Spoligotyping 和VNTR—MIRU基因分型技术，对来自全国不同地区 中，孔槽与应用的寡棱苷艘线垂直放置，将20¨LPCR琼脂糖凝胶电泳，在紫外成像检测系统下观察结果，