人肠组织特异抗原A33基因5%27调控区的克隆及转录调控的研究论文.pdfVIP

中国癌症研究进展@ 7 人肠组织特异抗原A33基因5 调控区的克隆及转录调控的研究 山松毛泽斌童坦君 人肠细胞表面抗原A33是最近发现的一种43J￡D的跨膜糖蛋白【lo]，它在细胞中的具体作 用至今仍不清楚。通过免疫组化研究发现，人A33抗原基因的表达仅限制在人的大肠、小肠 以及95％以上的肠癌、63％的胃癌和50％的胰腺癌中，而在其他组织与肿瘤细胞中则检测不 到它的表达”。1，表达具有很高的组织特异性，A33抗原已成为临床上单抗靶向治疗大肠癌研 究的热点”’4““。为了进一步研究A33基因组织特异表达的机理，我们克隆了人A33抗原基 因的5’调控区，并对该启动子区功能进行了初步分析。 材料和方法 l一)材料 TOPO 验室库存。fUR产物克隆载体PER一2．1 步法RT—PCR试剂盒购白Qiagen公司。 实验中所用引物均由上海生工生物技术公司合成。基因组步行法所用的两条引物为 TGTCTIEAGT(；TIGTCAIECIT一3’。用于A结合区突变的引物序列为： 57一GCA^AT^1EGGCAACA^GCll℃17rrrACIAGCll’Ge 5’一CCAAGcrAGTAAAAGA^O口1G7兀BcCCATAT兀、：C 用于B结合区突变的引物序列为： 57一GCATITCCC哪’A7I倪ATrATn℃CI℃1℃AGTrA 5’一乃“∞翻D|o；屯l彳乃“78GATAAAAAG口习一4死善 f--)基因组步行法克隆A33基因的启动子 RV，H／ncⅡ， Dm 作者单位：100083北京，北京大学医学部生物化学与分子生物学系 人晤组织特异抗原A33蓦固5‘弭控区的克隆爰转录调控的研究 司提供)对A33基因的启动子进行巢式PER扩增，产物在1．2％的琼脂糖凝胶上进行电泳分 和A33eDNA中设计上下游引物进行PCR鉴定。 (三)引物延伸实验寻找A33基因的转录起始位点 mg 总RNA与7—2P—A1甲末端标记的引物(106cprn)共同按下列程序进行引物延伸反应：70℃变 Bufferl．25 1．25 mol／LIYIT ml，25 m1．0．1 性10mill后置冰上，然后加入10×PCR nmtol／LMga2 1．25 nmaol／LdNTP0．5 ml，10 ml，42。C保温1 ml，42℃继 rain后加入反转录酶S,,pcrScriptⅡ0．5 DNMHinf 时加上末端标记的q)X}74 I Marker和一组测序反应作为分子基参照。 (四)RT—P．：R法检测A33基因的表达 RT— OneStep PCRKitHantlk，0l【进行RT—ICR反应，同时平行扩增GAPDH作内参。 (五)增强型绿色荧光蛋白基因对A33启动子5，缺失体活性的检测