人胸腺肽β4基因在大肠杆菌中的克隆、表达、纯化及促血管生成生物活性研究论文.pdfVIP

【关键词】南瓜蛋白，核澹体欠活簧白，抗肿瘤活性，结构，天花粉蛋白 人胸腺肽p4基因在大肠杆菌中的克隆、表达、纯化及促血管生成生 物活性研究 0093 贾琪，华子春+ 南京大学医药生物技术国家重点实验室，南京21 i n ylllos fj4(TB4)基因并进行分离纯化和 [摘要]H的：在大肠杆菌中克隆和表达人源T1 促血管生成生物活性鉴定。 方法：人工设计TB4基因，其密码子为大肠杆茼所偏爱，将合 成的寡核苷酸片段经分子克隆拼接成TB4基因片段，与pET28a(+)载体连接成重组表达质粒 8a-TB4，将其转化大肠杆菌BI。21(DE3)，经IPTG诱导表达带fIis。一Tag的融合蛋白 pET2 …S．一TB4，通过镍柱素和层析纯化，通过SDS-PA(；E分析签定，由CAM试验进行重组蛋白活 性的生物活性鉴定。 结果：经DXj＼序列分析鉴；之，堂组顾粒pET28a—TB4构建成功，IPTG 诱导后的融合蛋白}{iS．一TB4在欠肠杆菌中得到高效良达，并经一步纹柱亲和层析，即获得 纯化。CAM试验证明其有促进毛细血管生成的活性。结论：获得高效表达的、高纯度的 }{i SiIlfj s。一TB4融合蛋白，为Thymo4的进一步的功能分析和促血管生成生物活性研究奠定 了基础。 4；表达：镍柱纯化； CAM [关键词]人胸腺肽p f34，TB．4)足从胸腺鬃组分5(F5)中分离得剑的，是生物体内}i 胸腺肽f3，1(Thymosi『1 度最高儿t滔度保守的‘种B--Thymosin，它／fi仪存存于胸腺r{t，存机体众多组织【{1都有它的 踪迹，存参与d；q1了免疫及细胞生理i舌动等一‘系列过程r}t。古现助能多样‘m冈此吸引j’硎‘究者 细胞浆中，…jj：『有报道说它也仃细胞核的定位。据最近报通表fU]TB4町以促进毛细血管生成 和仓U伤愈彳}，降低炎症反应，抑制‘』I哇}i皮细胞的凋I’：，n：I_!】!三学治疗疾病c{t人有潜力。本文 没计并合成(TB4的编码琏冈，仆人肠杆荫中实现r已的^’五效农达，进行了分离纯化，并进 行』，jC促毛细血锊生成活·陀做J+辛Jj步撩定，为今后对TM篮fj功能的进‘步研究和药物开发 打F坫础。 1材料和方法 1．1试剂、质半讧及简株 CroBCA Kit购臼 心式琼脂糖DSA小{ll快速纯化试刺龠来闩l}1能}j≮彩生物科技有FI!公列；、Ii f)IF,RCEChemi ca]公id：＼i—IDA填料由本实验室提供。 1．2方；上 1．2．1 tR组质粒的构建 I．2．1．1TB,I li的坫f大】”段的捩识} p4(TB4)的丛f州序列，ff1XCBlt{-的人源序列，根捌人肠杆筒偏爱的密码f-使用 Thymosin 英俊(111Vitl·ogen)公r列合成。利』订Klenow酶将这些rj』物拼接和Taq肫扩增得剑我们所需 要的TB4。(如图1)PCR的循蚪参数为：95℃预变。陀5mjll肝，95℃变。陀40S，58℃复。陀 40 10min。PCR S，72℃延仲40S，循环28次，未次延仲为72C J矗物经甄川旨糖；疑胶}U泳掺 定、凝胶争也化试齐0盒}t芭化。 126 表1 Primers(5’3’)forp4 Thymosin l A‘I【；[CT6AC ATGGCT TlC AAAI。CC AAACCGGAC GAAA’I‘CGAAAAA