鼠抗人CCR3抗体对哮喘治疗作用的研究论文.pdfVIP

鼠抗人CCR3 抗体对哮喘治疗作用的研究 王 凯 沈华浩 浙江大学医学院附属第二医院呼吸科（310009） 过敏性哮喘是一种以气道慢性炎症、可逆性气道阻塞和粘液高分泌为特征的气道慢性疾病，病 因复杂，发病机制尚不明确。近年来的研究显示，Eos 是哮喘发病过程中主要的炎症细胞。 趋化因子是一类结构相似、分子量约为8－10KD，具有趋化功能的重要的细胞因子，通过作用 于靶细胞表面的趋化因子受体发挥生物学效应。根据半胱胺酸的相邻位置关系分为多个亚族。其中 C-C 亚族在气道炎症性疾病中有着重要的作用。CCR3(CCchemokinerceptor3)即CC 趋化因子受体3， 为一种受体蛋白，主要介导细胞对包括Geotaxis、Eotaxin-2、Eotaxin-3、RANTES 、MCP-3 、MCP-4 以及MIP-1 等多种CC 类趋化因子的反应并产生细胞迁移、活化等效应，其主要表达在嗜酸性粒细 胞、嗜碱性粒细胞以及肥大细胞、Th2 细胞、巨噬细胞上。Geotaxis 等炎症介质通过CCR3 激活Eos ， 吸引大量Eos 迁移到气道，导致气道炎症和气道高反应性的产生，引起哮喘的发作。而切断该炎症 通路的信号传导将抑制气道炎症的发生。 因此，当前通过抑制Eos 来防治哮喘日益受到重视，多种炎症因子拮抗剂在积极研究开发之中。 CCR3 是接受多个炎症介质信号的炎症介质受体，阻断了 CCR3 就可以阻断多个炎症介质的生物学 效应，因此拮抗或阻断Eos 表面受体CCR3 被认为是最诱人的研究方向。目前已经合成了包括抗CCR3 抗体的 CCR3 拮抗剂，并在一系列的研究中证实了 CCR3 阻断剂在哮喘治疗中的可行性。抗CCR3 抗体可与Eos 表面的CCR3 受体特异性结合，阻断Geotaxis 等炎症因子对Eos 的作用，使Eos 无法 向气道聚集，避免了Eos 对气道的破坏和哮喘的发病。本研究将观察采用人CCR3 细胞外NH2 端多 肽作为免疫原所制备的鼠抗人抗 CCR3 单克隆抗体对哮喘小鼠的哮喘的特征性病理改变气道炎症和 粘液高分泌的治疗作用。 材料与方法 采用多肽合成仪经“固相合成法”合成了 CCR3 细胞外区 NH2 端 30 个氨基酸的多肽序列为 （mttsldtvetfgttsyyddvgllcekadtr ），并进行多肽偶联和检测序列。以该多肽对BALB/c 小鼠进行免疫， 免疫以后眼球取血测定血清效价，血清里的抗体效价要在 1：6250 以上取免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤 细胞SP2/0 进行融合，筛选获得阳性克隆后产生并纯化抗体。 选择健康雄性的C57BL/6 小鼠，6 －8 周龄，体重18－22 ，分为4 组。哮喘模型组（Ova 组）： 以卵白蛋白（Ova ）作为抗原进行两次腹腔注射致敏（第0 ，14 天）和三次雾化吸入激发（第24 ， 25 ，26 天）。抗CCR3 抗体组（Anti －CCR3 组）：Ova 致敏和激发同Ova 组，每次激发前腹腔注射 抗CCR3 抗体（PBND03 ，3mg/Kg ）。非特异性Gig 组（Gig 组）：Ova 致敏和激发同Ova 组，每次 激发前腹腔注射非特异性Gig （3mg/Kg ）。空白对照组（Saline 组）：以生理盐水代替Ova 致敏和激 373 发。末次激发48 小时行肺泡灌洗，细胞计数，细胞因子检测，肺组织病理检查。 研究结果 1．抗CCR3 抗体（PBND03 ）对BALF 中炎症细胞的影响 Ova 组中的炎症细胞总数比Saline 组中的明显增高。和Ova 组相比，Gig 组中的炎症细胞总数 没有明显的变化，而Anti －CCR3 组中的炎症细胞总数明显降低。分类计数结果显示，与 Saline 组 相比较，Ova 组中的Eos 明显增高。Anti －CCR3 组中的Eos 较Ova 组明显降低，而Gig 组中的Eos 与Ova 组相比较却没有明显变化。各组间巨噬细胞、淋巴细胞均未见有显著性差异。 2 ．抗CCR3 抗体（PBND03 ）对Ova 致敏和激发后导致的哮喘小鼠气道炎症的影响 各组肺组织切片HE 染色用来观察哮喘小鼠的气道炎症浸润情况以及抗CCR3 抗体对气道炎症 的抑制作用。Saline 组：气道上皮完整，纤毛