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第二讲 细胞生物学 实验技术 邓宁 抗体工程研究中心 本章内容提要 • 第一节显微技术 • 一、光学显微镜 • 二、电子显微镜 • 三、显微操作技术 • 第二节生物化学与分子生物学技术 • 第三节细胞分离技术 • 第四节细胞培养与细胞杂交 第一节 显微技术 • 光学显微镜：以可见光（或紫外线）为光源 • 电子显微镜：以电子束为光源 — 、光学显微镜 普通光学显微镜的结构 • 3. 分辨力（resolution）：又称分辨本领，指将临近两点 清晰区分辨认的能力，分辨物体最小间隔的能力。 λ-入射光线波长； n－折射率 n sinα/2 －为镜口率 α=镜口角（样品对物镜镜口的张角）。 • 思考： 如何提高显微镜的分辨能力？ 几种介质的折射率 分辨极限（limit of resolution）：对于可见光来说，能 清楚分辨两点的极限是0.2 μm 0.61×0.5 Resolution＝ 1.5 ＝0.2 μ m • 显微镜的几个光学特点： – 制作光学镜头所用的玻璃折射率为1.65~1.78，所用介 质的折射率越接近玻璃的越好。 n sin α/2 的最大值必然小于1；介质为空气，镜口率一 般为0.05~0.95；油镜头用香柏油为介质，镜口率可接 近1.5。 – 普通光线的波长为400~700nm，分辨力数值不会小于 0.2 μm，人眼的分辨力为0.2 μm，因此显微镜的最大设 计倍数为1000X。 （二）荧光显微镜 Fluorescence microscope • 特点：光源为紫外线，波 长较短，分辨力高于普通 显微镜； • 有两个特殊的滤光片； • 照明方式通常为落射式。 （三）激光共聚焦扫描显微境 Laser confocal scanning microscope, LCSM • 用激光作光源，逐点、逐行、逐面快速扫描。 • 能显示细胞样品的立体结构。 • 分辨力是普通光学显微镜的3倍。 • 用途类似荧光显微镜，但能扫描不同层次，形成立体图 像。 激光共聚焦 扫描显微境 成像原理 （四）暗视野显微镜 dark field microscope • 聚光镜中央有挡光片，照明 光线不直接进人物镜，只允许 被标本反射和衍射的光线进入 物镜，因而视野的背景是黑 的，物体的边缘是亮的。 • 可观察4~200nm 的微粒子， 分辨率比普通显微镜高50倍。 （五）相差显微镜 • 利用光的干涉和衍射效应，把透过标本的可见光的光波 光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度， 使各种结构变得清晰可见。在构造上，相差显微镜有不 同于普通光学显微镜两个特殊之处。 1. 环形光阑 （annular diaphragm ）：位于光源与聚光 器之间。 2. 相位板 （annular phaseplate ）：物镜中加了涂有氟 化镁的相位板，可将直射光或衍射光的相位推迟1/4 λ。 （六）偏光显微镜polarizing microscope • 用于检测具有双折射性的物质，如纤维丝、纺锤 体、胶原、染色体等。 • 光源前有偏振片（起偏器），使进入显微镜的光线 为偏振光，镜筒中有检偏器（与起偏器方向垂直的偏 振片）。 • 载物台是可以旋转。 （七）微分干涉差显微镜Differential interference contrast microscope （DIC） • 1952年，Nomarski发明，利 用两组平面偏振光的干涉， 加强影像的明暗效果，能显 示结构的三维立体投影。标 本可略厚一点，折射率差别 更大， 故影像的立体感更 强。 （八）倒置显微镜