MegaBACE1000的荧光标记物（marker）开发.pdfVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００９，２９（１２）：９０～９３ 基于ＭｅｇａＢＡＣＥ１０００的荧光标记物（ｍａｒｋｅｒ）开发 １，２ １ 刘贤德 　张国范 （１中国科学院海洋研究所　青岛　２６６０７１　２福建省高校水产科学技术与食品安全重点实验室／集美大学水产学院　厦门　３６１０２１） ＴＭ 摘要　ＭｅｇａＢＡＣＥ １０００ＤＮＡ测序仪是由美国Ｐｈａｒｍａｃｉａ公司生产的一种高通量的ＤＮＡ测序 仪，利用这套测序仪，可以进行ＤＮＡ测序、遗传分析等相关研究。但该公司生产的用于遗传分析 的ＤＮＡ标记物（ｍａｒｋｅｒ）（ＥＴ５５０ＲＳｉｚｅＳｔａｎｄａｒｄｓ）价格不菲，出于节省成本的考虑，自行开发了荧 光标记物，经过验证，这个标记完全可以在 ＭｅｇａＢＡＣＥ１０００ＤＮＡ测序仪上使用。利用这套标记 物和自己开发的标记物识别软件，构建了一套基于ＭｅｇａＢＡＣＥ１０００ＤＮＡ测序仪的改良的、高通 量的ＡＦＬＰ操作流程。 关键词　ＭｅｇａＢＡＣＥ　标记物（ｍａｒｋｅｒ）　ＡＦＬＰ 中图分类号　Ｑ８１９ 　　ＭｅｇａＢＡＣＥ１０００ＤＮＡ测序仪由美国Ｐｈａｒｍａｃｉａ公 母本、中国大连付家庄海区的１个野生皱纹盘鲍（标记 司生产，采用９６通道毛细管电泳系统，具有高通量和 为Ｃ）为父本构建家系，子代共有８６个个体用于ＡＦＬＰ 自动化程度高等特点，在质粒和ＰＣＲ产物质量保证的 分析。质粒由浙江大学分析测试中心华家池分中心高 前提下，测序长度可在５００～１０００碱基之间。该测序系 其康教授提供。 统广泛应用于基因组、功能基因组、ＥＳＴ、遗传分析、遗 １．２　引物、试剂及仪器 传图谱构建、基因芯片制备前所需的大规模 ＤＮＡ序列 　　用于质粒扩增的引物ＭＥＸ（５′端标记ＴＡＭＲＡ荧光 分析等领域。但该公司用于遗传分析的ＤＮＡ标记物 染料）、 Ｍ１３和５０４３以及ＡＦＬＰ引物均由上海博亚公司 （ＥＴ５５０ＲＳｉｚｅＳｔａｎｄａｒｄｓ）十分昂贵，出于节省成本的考 合成，限制性内切酶ＭｓｅＩ购于ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏＬａｂｓ公 虑，我们自己开发了一套基于ＭｅｇａＢＡＣＥ１０００ＤＮＡ测 司，ＥｃｏＲＩ、Ｔ４连接酶购于Ｐｒｏｍｅｇａ公司，ＨｉｎｄＩＩＩ购于 序仪标记物。我们的基本思路是：采用不同的质粒（其 ＭＢＩ公司。ＰＣＲ试剂购自上海申能博采公司。Ｇｅｌ 中含有长短不一的插入片段），选用带有荧光标记的引 Ｍａｔｒｉｘ购自ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ公司。ＰＣＲ反应在 物进行ＰＣＲ扩增（其中的两个ＰＣＲ产物需进行酶切）， ＡＢＩ公司生产的ＭＪ２２５ＰＣＲ仪上进行。ＰＣＲ产物的 这样就可以得到从几十个碱基到几百个碱基的片段， 纯化在Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ５８０４Ｒ离心机（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ公司）上进 混合之后就可以当作标记物使用。使用这种标记物和 行。选择性扩增产物的检测在 ＭｅｇａＢＡＣＥ１０００ＤＮＡ 自己开发的标记物识别软件，我们建立一个改良的、高 测序仪（美国Ｐｈａｒｍａｃｉａ公司）上进行。 通量ＡＦＬＰ程序。 １．３　标记物设计与ＰＣＲ扩增 １　材料与方法 　　我们设计的标记共包含 ８个片段（从 ６４ｂｐ到 ４９２ｂｐ），所用引物组合、限制性内切酶情况见表 １。 １．１　材　料 ＰＣＲ反应体系：１０ｌ１０×Ｔ