一种新型的通过免疫富集纯化溶酶体方法.pdfVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１３，３３（１１）：５１５５ 檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪殏 檪 殏 檪 技术与方法 檪 殏 檪 殏檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪 一种新型的通过免疫富集纯化溶酶体方法 张　磊　阳　宇　吴传芳 （四川大学生命科学院　成都　６１００６４） 摘要　用传统的密度浓度梯度法分离溶酶体具有耗时长，样品需求量大，而且无法得到纯度较高 的溶酶体等不足，因此有必要开发一种简便分离溶酶体的方法。依据溶酶体膜蛋白ＬＡＭＰ２的特 性，开创性地尝试用免疫富集溶酶体膜蛋白的方式纯化溶酶体：首先构建了带Ｆｌａｇ标签的ＬＡＭＰ２ 真核表达载体，并转染Ｈｅｌａ细胞，用免疫荧光鉴定其亚细胞定位情况，发现重组蛋白ＬＡＭＰ２Ｆｌａｇ 特异性定位于溶酶体。在Ｈｅｌａ细胞中筛选得到了稳定表达ＬＡＭＰ２Ｆｌａｇ的细胞系。大规模培养 该细胞系，在非变性条件下分离细胞质提取物，利用ａｎｔｉＦｌａｇ抗体做免疫沉淀，用蛋白质免疫印 迹检测，发现沉淀产物中特异性富集了溶酶体标识蛋白ＬＡＭＰ１。用糖苷酶活性检测，发现沉淀产 物中酸化蛋白酶活性很高，表明富集到较纯的溶酶体。这种改良的新型方法步骤简捷，样品需求 量少，获得的溶酶体纯度高，为从少量细胞中分离溶酶体提供了一个种优化方案。 关键词　分子生物学　细胞器分离　免疫共沉淀　溶酶体 中图分类号　Ｑ８１３ 　　溶酶体（ｌｙｓｏｓｏｍｅ）是真核细胞中由单层脂蛋白膜 体具有耗时长，样品需求量大，而且无法得到纯度较高 包绕的富含一系列酸性水解酶的细胞器，常常被比拟 的溶酶体等不足［１２］，探索一种简便、高效、特异性高的 成细胞的“胃”，是细胞内吞和细胞自噬两条代谢途径 溶酶体纯化方法具有非常重要的意义。 ［１２］ 的共同终点 。溶酶体既能通过与吞噬体融合，酸化 　　ＬＡＭＰ２是溶酶体表面特异性定位的膜蛋白，被广 水解通过内吞途径进入细胞的生物大分子物质，调节 泛的用作溶酶体的标识物。ＬＡＭＰ２蛋白分子的大部分 ［３４］ 细胞水平的信号传递 ，又能通过与自噬体融合，降 区域定位于溶酶体的内腔中，仅有 Ｃ端一小部分跨过 解通过自噬途径包裹到自噬体中的细胞器和内源性生 溶酶体膜，暴露在溶酶体表面与胞浆接触［８］。依据 物大分子，为细胞提供生物合成的新原料［５６］。 ＬＡＭＰ２的特性，本研究在 ＬＡＭＰ２的Ｃ端加上 Ｆｌａｇ短 　　通过分子生化手段分离高纯度的溶酶体对于研究 肽序列，连接载体，构建稳定表达 ＬＡＭＰ２Ｆｌａｇ的Ｈｅｌａ 细胞内吞和细胞自噬两条代谢途径具有重要意义。目 细胞系。在非变性条件下裂解细胞，通过免疫共沉淀 前应用于分离溶酶体的主流方法是密度梯度离心。密 方法分离带有 ＬＡＭＰ２Ｆｌａｇ的溶酶体。免疫印迹和糖 度梯度离心是一种从组织或大量细胞的匀浆液中通过 苷酶活性检测结果表明该方法能有效富集较纯的溶 超速离心分离特定细胞成分的方法。它利用特定介质 酶体。 中不同细胞器沉降系数不同，先通过离心力场，让不同 ２　材料与方法 细胞器分布到不同密度的区域中，随后检测各层分离 物中特定细胞器标识蛋白或标识酶的含量，鉴定并分 ２．１　材　料 ［７］ 离目标细胞器 。由于使用密度浓度梯度法分离溶酶 ２．１．１　细胞株、菌株和质粒　人类宫颈癌细胞系Ｈｅｌａ 收稿日期：２０１３０９２３　　修回日期：２０１３１００９ 购自ＡＴＣＣ，由本实验室保存和传代，ｐｃＤＮＡ３．１（＋）质 通讯作者，电子信箱：ｗｕｃｈｕａｎｆａｎｇ＠ｇｍａｉｌ．ｃｏｍ 粒和菌株Ｅ．ｃｏｌｉＴＯＰ１０均由本实验室保存。 ５２