甘蓝型油菜BnClo1基因克隆,表达载体构建及原核表达.pdfVIP

中国农业科学 2010,43(2):252-258 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2010.02.004 甘蓝型油菜 BnClo1 基因克隆、表达载体的构建及原核表达 1 2 1 丁 勇 ，常 玮 ，刘小烛 1 2 （西南林学院资源学院，昆明 650224 ； 中国科学院昆明植物研究所，昆明 650204 ） 摘要：【目的】克隆甘蓝型油菜（ Brassica napus ）油体钙蛋白（caleosin）基因 BnClo1，并进行原核表达 研究。【方法】在获得甘蓝型油菜BnClo1 基因全长 cDNA 的基础上，根据 BnClo1 基因编码区设计 1 对特异引物， 以甘蓝型油菜种子总RNA为模板，通过RT-PCR获得了约750 bp的cDNA 片段，T/A克隆后进行序列测定。随后将 该蛋白成熟肽cDNA片段克隆到原核表达载体pTYB12中，构建融合表达载体pTYB12-BnClo1，转化到Escherichia coli ER2566（DE3）中进行表达。【结果】测序结果显示，RT-PCR获得的cDNA全长768 bp，包含完整的开放阅读 框738 bp，编码245个氨基酸残基，caleosin分子量为28.1 kD。原核表达产物经SDS分析表明，以20℃、 4 mmol·L-1 IPTG诱导该基因表达效果最好，诱导产物为一个与理论值相符的83.1 kD的融合蛋白intein-caleosin。 【结论】克隆了油菜BnClo1 基因，并在大肠杆菌中进行了优化表达。为进一步纯化和鉴定目的蛋白，及研究其功 能奠定了试验基础。 关键词：甘蓝型油菜；油体钙蛋白；BnClo1 基因；原核表达；pTYB12 Molecular Cloning, Expression Vector Construction and Prokaryotic Expression of BnClo1 Gene from Brassica napus 1 2 1 DING Yong , CHANG Wei , LIU Xiao-zhu 1 2 ( School of Natural Resources, Southwest Forestry University, Kunming 650224; Kunming Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences, Kunming 650204) Abstract: 【Objective 】BnClo1gene cloned from Brassica napus was expressed in Escherichia coli ER2566. 【Method 】 A cDNA fragment about 750 bp was amplified from the total RNA of rape seeds by reverse transcription PCR (RT-PCR) with a pair of specific primers based on the seq