RNA干扰对大鼠肝星状细胞COL1A1基因表达影响.pdfVIP

·中文论著摘要· RNA干扰对大鼠肝星状细胞COLlAl基因表达 的影响 目 的 fibrosis)是肝硬化前期的病理过程，可由多种原因引起， 肝纤维化(hepatic 在我国主要是乙型病毒性肝炎，酒精性肝纤维化作为其病因近年也呈上升趋势， 目前对于肝纤维化的防治尚无确切有效的手段。肝纤维化的主要病理过程是细胞 cell 外基质(extra 脏胶原蛋白占总蛋白5—10％，其中I型胶原蛋白占总胶原蛋白的40--50％，III 型胶原蛋白占总胶原蛋白的40一50％，肝纤维化时胶原蛋白可占总蛋白的50％甚 至更多，其中I型胶原蛋白占总胶原蛋白的比例升至60-70％，III型胶原蛋白降至 20--30％。可见肝纤维化时主要是肝脏中I型胶原过度增加的结果。现已证明， 肝纤维化是一种可逆的病理过程，因此本研究设计针对大鼠前I型胶原Q1链 抑制效果，为肝纤维化的基因治疗提供新的靶标。 实验材料与方法 一、实验材料 DH5a、质粒抽提试剂盒、限制性内切 真核表达载体pGPU6／GFP／Neo、E．coli 酶BamHI、BbsI、Pst 2000、G418、COLlAl I、T4连接酶、Taq酶、Lipofectamine 兔多克隆抗体、13-actin兔抗人多克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗、 大鼠肝星状T6细胞 二、实验方法 1、筛选siRNA序列和构建重组质粒 从NCBI网站获得大鼠的COLlAl 不同位点的siRNA序列，合成双链DNA(double．strandedDNA)连接到带有U6 pGPU6／GFP／Neo—shRNA—B、pGPU6／GFP／Neo-shRNA—C。 2、细胞转染 通过脂质体介导的方法将重组质粒转染到大鼠肝星状细胞株HSC．T6细胞中。 经G418进行稳定筛选，2周后选择单克隆扩大培养。 3、检测抑制效果 采用蛋白印迹(Westemblowing)方法检测I型胶原蛋白表达情况。 4、统计处理 实验数据以i姆表示，采用SPSSl3．0软件分析数据，组间比较采用多组单因 素方差分析(ANOvA)，P0．05为差异有统计学意义。 实验结果 l、选择的针对COLlAl基因的siRNA序列 COLIA I、Pst 2、重组质粒经BamH 1分别单酶切后，阳性质粒进行测序分析，结果 mRNA的3个重组质粒的shRNA序列与设计的完全一致，构 证实靶向COLlAl 建成功。 3、经Western 别为26．93％44．86％、66．29％。 结论 成功构建了3个针对大鼠COLlAl的质粒载体，对I型胶原的表达都产生了 的途径。 关键词 Western 前I型胶原a1链肝星状细胞RNA干扰质粒shRNAblotting 2 ·英文论著摘要· InhibitionofCOLIAI RNA expression by nil。tlratestellatestellateccell hepatic hepatic ective