人乳腺癌细胞株MCF-7及其紫杉醇耐药株中紫杉醇结合的差异蛋白质分析.pdfVIP

· 218 ‘ 中国药理学通报 ChinesePharmacologicalBulletin 2010Feb；26(2) 1．1×10 mmo])为底物溶于 l0mI的CH2C1：中， 得的差异结合蛋白。收集细胞，RIPA裂解液冰上裂 DCC(100mg，4．87×10“mmo1)脱水，DMAP(15．5 解 30min，4cI=12000r·min 离心 10min，取上 mg，1．27×10 mmo1)，N2催化溶于无水二氯甲烷 清，BCA法(Pierce公司)蛋 白定量。加入SDS载样 制备生物素化紫杉醇。HPLC—MS法 (WatersQ—Tof 缓冲液煮沸 5min，行 SDS—PAGE电泳，上样量为 Premier ) 分析鉴定反应产物，根据色谱图的出 0．1mg总蛋 白。半干法电转移4h，室温封闭1h， 峰情况，相应收集各个色谱峰，将其浓缩蒸干，冷冻 取抗体4℃摇床上孵育过夜，洗膜3次，二抗 (HRP一 干燥后分析产物的纯度、分子量和化学结构，判断紫 羊抗兔 IgG)室温封闭1h，ECL显影。显影后硝酸 杉醇的产物峰，进行分离。 纤维素膜经洗脱后二次杂交，胶片经凝胶成像分析 1．2．3 生物素化紫杉醇的生物学活性鉴定 收获 系统扫描、成像。 对数生长中期、生长状态 良好的亲本 MCF-7细胞， 1．2．8 统计学方法 采用SPSS16．0统计软件作 t 消化后在 96孔板 (Costar公司)中按 SRB法接种， 检验分析 尸值。 每孔接种 7X10。细胞，CO 培养箱中常规培养，第 2 结果 一 列无细胞空白对照组，第二列无药物空 白对照组， 2．1 生物素化紫彬醇的获得 利用本方法成功获 培养24h后在余下各列中加入不同浓度的生物素 得了生物素化紫杉醇，经 HPLC．MS检测整个反应的 化紫杉醇(8复孔)，在第二列空白对照组中同时加 1 O 1 0 1 所有产物峰仅有4个峰，且紫杉醇和生物素化紫杉 ∞ ％ 0 ∞ ％ O ∞ ％ O 入含DMSO的等量溶剂进行染色，于酶标仪上515 醇峰占绝对多数，副产物较少，纯度较高，Fig1。 nm处测各孔OD值，计算各药物浓度作用下的细胞 A 生长抑制率。绘制不同加药浓度下的细胞生长抑制 BiotinylatedPaclitaxel 7：DiodAtray 238 O61101．7 曲线，计算生物素化紫杉醇对细胞的半数抑制浓度 782e6 IC50。 1．2．4 生物素化紫杉醇和免疫磁珠的偶联 将标 记有亲和素的亲和甄别磁珠转移至 1ml离心管中， 置于磁力收集器上，用 600Ixl0．02otol·L。。PBS pH=7．4洗涤磁珠，一共洗涤 3次。然后加入 1ml 2×10～otol·L 的生物素化紫杉醇 (溶于甲醇 中) ，37~C避光，轻柔晃动充分吸附反应 30min， 然后用磁力收集器将免疫磁珠与溶液分开，并用pH 7．4的PBS反复洗涤5次，将溶液中没有和磁珠结 5．00 l0．00 l5．00 20．00 25．00 30．00 Time 合的生物素化紫杉醇洗去，最后保存在原装的免疫 B BiotinylatedPaclitaxel 1：ScanES一 磁珠储存液中，留着备用。 06