赤魟软骨血管生成抑制因子的制备【毕业论文】.doc

本科毕业论文 （20 届） 赤魟软骨血管生成抑制因子的制备 目 录 摘要 3 关键词 3 1前言 5 2实验材料与仪器 5 2.1原料 5 2.2试剂 6 2.3仪器 6 3实验方法 6 3.1分离提取赤魟总蛋白 6 3.2紫外吸收法绘制蛋白标准曲线并测定蛋白质含量[6] 7 3.3抗氧化活性测定 7 3.3.1清除DPPH 自由基的能力测定（DPPH法）[7] 7 3.3.2还原能力的测定（铁氰化钾还原法）[8] 7 3.3.3清除羟自由基能力的测定（邻二氮菲—Fe2+氧化法）[9-11] 7 3.4离子交换层析[12] 8 3.4.1 cellulose ED-52部分参数 8 3.4.2 实验步骤 8 3.4.3 电泳实验[13] 9 3.5凝胶过滤层析[14] 10 3.5.1 Sephadex G-75的预处理 10 3.5.2 安装层析柱 10 3.5.3 填装 10 3.5.4 平衡 10 3.5.5 上样 11 3.5.6 洗脱 11 3.5.7 收集 11 3.5.8 保存 11 3.5.9电泳实验 11 3.6 DAFN抑制鸡胚绒毛尿囊膜CAM血管生成的测定[15] 11 4 结果与分析 11 4.1抗氧化活性测定 11 4.1.1 60%硫酸铵提取物与100%硫酸铵提取物DPPH清除率的比较 11 4.1.2 60%硫酸铵提取物与100%硫酸铵提取物羟自由基清除能力的比较 11 4.1.3 60%硫酸铵提取物与100%硫酸铵提取物还原力的比较 12 4.2离子交换层析 12 4.2.1 紫外检测 12 4.2.2 抗氧化能力 12 4.2.3高效液相分析 12 4.2.4电泳实验分析 13 4.3凝胶过滤层析 13 4.3.1 紫外检测数据 13 4.3.2抗氧化能力 14 4.3.3 高效液相分析 14 4.3.3 电泳实验分析 14 4.4 DAFN抑制鸡胚绒毛尿囊膜CAM血管生成的测定 15 5小结 16 5.1硫酸铵分级沉淀 16 5.2柱层析方法 16 5.3抗氧化活性研究 16 5.4新生血管生成抑制因子 16 参考文献 17 致 谢 18 附录Ⅰ英文翻译 19 附录Ⅱ英文原文 28 赤魟软骨血管生成抑制因子的制备 目的：从赤魟软骨中分离纯化出具有较强抗氧化活性的蛋白，并对其抑制新生血管的能力进行比较分析。方法：将赤魟软骨粉碎后离心，用(NH4)2SO4分级沉淀得粗蛋白，通过离子交换层析和凝胶层析进行分离纯化，电泳检测蛋白分子量，用DPPH清除率、羟自由基清除率、还原力比较分段部位和单体的抗氧化蛋白活性，比较其对鸡胚绒毛尿囊膜CAM血管生成的抑制程度。结果：经过分离纯化，得到了赤魟软骨血管生成抑制因子（DASN），提取率为1009 : 1；12%的SDS电泳结果所示，考马斯亮蓝染色显示为单一条带，证明已达到电泳纯，根据标准蛋白质的迁移率，测得其分子量为58.2 kDa；运用CAM活性抑制模型进行药理学研究分析发现，8 μg DASN对新生血管的抑制率已经高达82.7%，表明DASN能显著抑制CAM膜新生血管生成，并且抑制效果具有一定的浓度依赖性；DPPH清除率、羟自由基清除率、还原力三种体外抗氧化实验显示，DASN的清除率分别为84.41%、59.13%、0.262。结论：本实验运用多种现代分离技术从赤魟中分离得到的DASN具有显著的血管生成抑制作用，是抗肿瘤新药研发的重要资源。 赤魟；新生血管抑制因子；抗氧化 Preparation of neovascularization inhibitor factor from Dasyatis akajei Abstract：Objective: The angiogenesis inhibitors was isolated and purified from Dasyatis akjei, and its antioxidant activities and angiogenesis inhibiting effect were also evaluated. Methods: The cartilage of Dasyatis akjei was chopped and extracted. The supernatant was collected and centrifuged. The crude protein was fractioned through precipitation with ammonium sulfate and centrifugation. The sediments were collected, dialyze and lyophilized. The following purifica