6His—hVEGF165融合基因真核表达载体的构建和鉴定.pdfVIP

2010年3月第7卷第7期 论 著 · 6His—hVEGF165融合基因真核表达载体的 构建和鉴定 张显玉 ，王 涛 ，陈伟华 ，庞 达 (1．哈尔滨医科大学附属肿瘤医院乳腺外科 ，黑龙江哈尔滨 150081；2．哈尔滨医科大学附属 第 四临床医学院整形外科 ，黑龙江哈尔滨 150001) 摘【要】目的：本实验拟构建hVEGF165基 因的真核表达载体 ，为其应用于治疗大鼠缺血皮瓣的研究奠定基础。方法 ： 设计引物 P1和 P2，在每一个引物的两端分别添加BamHI、XhoI酶切位点。从人外周血中提取总RNA，用RT—PCR 方法得到hVEGF165的cDNA。随后再将得到的cDNA连人中间载体 pMD19一T，得到 pMDI9一T—hVEGF165，双酶切 鉴定并测定序列。将hVEGF165的cDNA亚克隆到真核表达载体 peDNA6／HisA中，构建 hVEGF165真核表达载体 pcDNA6-hVEGF165。结果：对pMD19-T-hVEGF165的测序结果表明，本研究成功地从人外周血中扩增到hVEGF165的 cDNA。将hVEGF165定向克隆人真核表达载体peDNA6H／isA。经双酶切及 PCR鉴定，将阳性克隆测序 ，经测序证实序 列正确。结论：本研究成功地构建了VEGF165真核表达载体pcDNA6一hVEGF165，并且 目的基因上游融合有His标签。 f关键词1Ⅶ GF165；皮瓣；载体构建 ；融合基 因 中【图分类号】R34 文【献标识码】A 文【章编号】1673—7210(2010)03(a)一019—04 Constructi0n and identificati0n 0feukaryotic expression vectorf0lr 6His—hVEGF165 zHANGXi0vl WANGT CHEN Weihua?,PANGDa1 (1．DepartmentofBreastSurgery，theTumorHospitalofHarbinMedicalUniversity，Harbin 150081，China；2．Department 0fReconstructionSurgery，theFourthClinicalHospitalofHrabinMedicalUniversity，Hrabin 150o01，China) A【bstract】Objective：ToconstructeukaryoticexpressionvectorofhVEGF165tolaythefoundationforthestudyofthe treatmentofischemicratskinflaps．M ethods：TwospecificprimersP1andP2weredesigned．restrictionenzymecutting siteofBamH IandXho1wereintroducedintothetwoendsofeachprimer．Weisolatedmononuclera cellsfrom human venousbloodandgotoutthetotalRNA andthenthehVEGF165cDNA wasclonedbyusingRT-PCR．W eclonedthe cDNA intoPMD19一Tvector．namedpMD19一T—hVEGF165．ThepositiveclonewassentofrDNA sequencingafterblue- whiteselectionnadidentificationbydoubleenzymesdigestion．ToconstructtheeukaryoticexpressionvectorofhVEGF165， wesubclonedthecDNA intotheeukaryoticexpressionvectorpeDNA6／