厦门近海温泉微生物多样性及热稳定纤维素酶研究.pdf

摘要 摘 要 温泉与地球早期环境比较接近，其中微生物生态系统相对简单、稳定和封闭， 对其进行微生物多样性的研究不仅有助于认识高温环境中的微生物遗传多样性 与功能多样性，揭示温泉中嗜热菌的多样性及其与环境的关系，而且对认识生命 的起源和进化具有十分深远的意义。 嗜热菌是地球独特的生物资源和珍贵的科研素材。温泉中存在丰富的嗜热菌 资源,它们有着奇特的耐高温特性。由嗜热菌产生的热稳定酶在工业和分子生物 学等领域有重要的应用。研究和开发纤维素酶在生物质能源领域具有重要的作 用，特别是热稳定的纤维素酶具有良好的应用前景。 本研究利用分子生物学技术，以非培养的方式对厦门近海温泉沉积物的细菌 和古菌的群落组成进行了研究。采用细菌16S rDNA 基因通用引物Euba16F/ 1492R扩增细菌16S rDNA，分别构建了3 个温度梯度的细菌16S rDNA 基因文 库，并进行ARDRA分析和系统发育分析。结果发现：三种温度温泉的细菌主要 分布在变形杆菌门（Proteobacteria ）、产水菌门(Aquificae)、拟杆菌门 （Bacteroidetes ）、绿屈挠杆菌门（Chloroflexi ）、异常球菌-栖热菌门 (Deinococcus-Thermus)、热袍菌门（Thermotogales ）、厚壁菌门(Firmicutes)、酸 杆菌门（Acidobacteria ）等类群，以及一些未知的类群。Proteobacteria 在三个温 度沉积物中的种类及数量最为丰富，所占比例在70%~87%之间。三个温度沉积 物中都是以变形杆菌为优势群落，其中Alphaproteobacteria在90℃温泉中属于优 势类群，比例占37.5% 。Betaproteobacteria是70℃和80℃的温泉的优势菌群，比 例分别为43.9%和50.6% 。 采用古菌16S rDNA 基因通用引物Arch21F和Arch958R扩增古菌16S rDNA， 构建了两个温度的温泉样品的古菌16S rDNA文库，结果表明，温泉样品的古菌 属于两大类群：泉古菌(Crenarchaeota)和广古菌(Euryarchaeota) 。泉古菌是近海温 泉的优势菌群。80℃样品中泉古菌的比例占89.2%，70℃样品中泉古菌占91.3% 。 大多数克隆与来自陆地温泉和深海热泉的不可培养克隆具有同源性。70℃样品中 还有一个克隆SA－61，属于古菌界的未知类群。古菌主要分布在泉古菌的热变 形菌目(Thermoproteales)和硫还原球菌目（Desulfurococcales ）和未知的亚群、以 及广古菌的热球菌目 (Thermococcales)和古丸菌目(Archaeoglobales) 。在已知的类 I 摘要 群中，70℃和80℃温泉中硫还原球菌目（Desulfurococcales ）属于优势类群。 采用纯培养的方法，从美国内达华州温泉和中国福建永泰温泉分离得到100 多株嗜热细菌。从中筛选得到产纤维素酶和半纤维酶的嗜热细菌并进行了 16S rDNA 鉴定。LY7 和LY8 是产纤维素酶的嗜热细菌，菌株LY7 属于脂环酸芽孢 杆菌属(Alicyclobacillus sp.) ；菌株LY8 属于土芽孢杆菌属(Geobacillus sp.)生长范 围在40～70℃之间，最适温度 65°C 。LY-1 、LY-2 、LY-3 和LY-4 是产半纤维素 酶的嗜热菌，属于土芽孢杆菌属(Geobacillus sp.)，生长范围在40～70°C 之间， 最适温度55°C 。 在许多微生物降解纤维素过程中，β-葡萄糖苷酶是限速酶，若β-葡萄糖苷酶 酶活低，会导致纤维二糖的累积从而抑制内切葡聚糖和外切葡聚糖酶活，影响整 个纤维素降解进程。为了大量获得β-葡萄糖苷酶并研究热稳定β-葡萄糖苷酶的性 质，从温泉嗜热细菌Geobacillus sp. LY8中克隆了热稳定的β-葡萄糖苷酶基因。从 氨基酸序列分析，该酶属于糖苷水解酶类第一家族。将Geobacillus sp. LY8的β- 葡萄糖苷酶基因与pGEX －4T-2连接，转化大肠杆菌构建了重组菌，进行了β-葡 萄糖苷酶的高效表