甲基化特异性熔点曲线分析检测FMR1基因CpG岛甲基化状态方法的建立.pdfVIP

塑至堑 至 兰堂塑 v。l46N。4 JF edllniv 2012August, M ujianMedUniv … … 255 甲基化特异性熔点曲线分析检测 FMR1基因 OpG岛甲基化状态方法的建立 富显果 ，廖 娟 ，张 朵，严爱贞，郭小燕，兰风华 摘要： 目的 建立一种可靠的检测脆性 x智力障碍 1基因(FMR1)CpG岛甲基化状态的方法。 方法 用 亚硫酸氢钠对基 因组 DNA进行脱氨基修饰 ，以修饰后 的DNA为模板 ，利用荧光定量 PCR仪扩增 FMR1基 因 CpG岛序列并进行熔点曲线分析，并对 PCR产物进行克隆测序，验证其 甲基化状态。 结果 分析包含 lO个 CpG位点 FMR1基 因CpO岛 105bp片段显示 ，非 甲基化与 甲基化引物扩增产物之间熔点温度相差 2．5℃；克隆 测序显示两者之间未被修饰 的胞嘧啶相差 7个 。 结论 所建立 甲基化特异性熔点曲线分析方法可 以有效地检 测 FMR1基因CpG岛甲基化状态 ，为临床诊断脆性 x综合征提供依据 。 关键词 ： 脆性 X综合征 ；CpG岛；甲基化 中图分类号 ： R596．026；R394．2；R394．3 文献标识码 ： A 文章编号 ： 1672—4194(2012)04—0255—04 脆性 X综合征 (fragileXsyndrome，FXS)是一 引物，甲基化与非 甲基化 PCR预期扩增产物均为 种常见的遗传性智力障碍疾病 ，其发病率在男性约 105bp，下划线示两对引物 由于亚硫酸钠处理后的 为 1／4000，女性约为 1／8000E~]。 目前认为，9596／以 差异 (表 1)，引物 由上海生工生物工程有 限公司 上的FXS患者是 由其疾病基因一 脆性 X智力障 合成 。 碍 1基 因 (fragileX mentalretardation lgene， 表 1 CpG 岛甲基化熔 点曲线分析 PCR引物 FMR1)5端非翻译 区有一个 CGG三联核苷酸重复 Tab 1 PrimersformethylationcurveassayofCpG islands 序列异常扩展，引起 FMR1基 因 5端 CpG岛异常甲 引物 tN期扩增片段 基化而引起。本实验通过建立 甲基化特异性熔点曲 bp 线分析方法来检测FMR1基因CpG岛甲基化状态。 甲基化 PcR MF GTGACGTGGTTTrIAGTGTTT rA、rT 1 材料与方法 MR CTCAAAAACGACCCTCCACCG 1．1 研究对象和样本 FXS疑似患者家系，男性 4 非甲基化 PCR UMF GTGATGTGGTTTTAGTGTTTATATT 105 例 ，女性 6例 ，其 中疑似患者为男性 ，25岁，具有 ～ UMR CTCAAAAACAACCCTCCACCA FXS相关表型(如大耳 、尖下 巴及智力低下)，其弟 — — — — 及 2个姐姐所生的儿子有相似 的表现。另 以 10例 健康人 (均来 自笔者 医院体检 中心)的外周血为对 1．3 方法 照 ，男性 5例 ，女性 5例 。