园艺植物原生质体融合技术研究进展.docVIP

1 引言 原生质体融合protoplast fusion）亦称细胞融合（cell fusion）、体细胞杂交（somatic hybridization）、超性杂交（Para sexual hybridization）或超性融合（Para sexual fusion ），是指不同种类的原生质体不经过有性阶段，在一定条件下融合创造杂种的过程[1]。植物细胞融合技术包括原生质体的制备、细胞融合的诱导、杂种细胞的筛选和培养，原生质体融合可避免受精作用中的种的特异性配子识别反应，有可能打破远亲杂交中的有性亲和界限。原生质体技术还可用于种质资源的保存、细胞突变体的筛选、细胞器移植和外源DNA的导入等方面20世纪60年代，是基因重组技术的一部分。经过一定的理化条件处理,使外源目的基因进入受体细胞，并得以表达，以期使得受体细胞在原有性状的基础上，获得所需的新的特殊性状[2]。1953年we bull首先用肤聚糖水解酶，溶菌酶得到巨大芽胞杆菌的原生质体，1960年Cocking用酶法分离出番茄根原生质体后Nagata等首次利用烟草叶分离原生体，经培养获得再生植株1985年Fujimura等率先在水稻原生质体培养中获得了再生植株 并从许多种内、种间、属间甚至亚科间的体细胞杂交获得杂种细胞系或杂种植株。随着多种植物原生质体的成功培养和融合技术的不断改进，，，Ca+高pH法、聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)、PEG与高Ca+ 高pH相结合法、电融合法以及聚集微束激光法。目前，国内外实验室广泛使用的是化学法中的PEG一高Ca+ 高pH 法和物理法中的电融合法。 2.1电融合法 20 世纪80 年代初开始探索使用电融合法，1979年Senda建立的电融合法是目前最流行的物理诱导融合方法[5]。其原理是利用原生质体在交变电场作用下相互接触并排列成串后，施加一次或几次高压直流电脉冲，使相互接触的原生质体质膜发生局部可逆击穿，形成融合体。该方法避免了化学药剂的毒害作用，操作简便，快速，融合同步性好，可在显微镜下观察融合的全过程，整个过程中的参数容易控制细胞电融合。近年来，已经测出数十种植物原生质体的电融合参数，并获得部分细胞杂种。这是近年来融合技术上取得的最突出的成就，有可能解决融合细胞的选择问题[6]。利用电融合法获得了菊花与智利喇叭花(茄科)的科间杂种 (D．×grandiflorum×Salpiglossis sinuateu)、菊花与大籽蒿的属间杂种(D．×grandiflorum×Artemisia sieversiana )、莴苣属内种间杂种(L．sativa×L．virosa 、L．sativa×L．perennis、L．sativa×L．tat Arica ) Sherraf等[20]用电融合法诱导野生型番茄和耐盐系双单倍体土豆融合，得到再生植株，并得到介于双亲中间型的叶片和地下果实，杂种的耐盐性降低了50%。Brewer等[21]用电融合法诱导了植株矮小但可富积重金属锌和镉的Thlaspicaerulescens和植株较高大的Brassica nap us融合，并得到在含高锌和镉的土壤中存活的再生植株，使通过体细胞杂交将高积累重金属品系的基因转移到其它植物中成为可能。 2.2 PEG一高Ca+ 高pH 法 1974年Kao 建立了聚乙二醇(PEG)法，经过不断改进建立起来的PEG一高Ca+ 高pH 法，至今应用广泛。原生质体融合的报道多采用了该方法。但融合频率不高仍是这项技术的弱点。Kiriti等报道的融合频率为5%，Chen等报道的融合频率约4.5% 。细胞融合要求新鲜的原生质体，Zhao等发现，在2-4 h内已有部分细胞生出了新的细胞壁。近年来一些研究者发现，加入二甲基亚砜(DMSO)可以有效地提高融合频率[7]。孙蒙祥等报道，用PEG诱导选定的成对原生质体融合，从而使PEG融合技术更精确化，由此可能省去杂种细胞筛选步骤。利用PEG法相继获得了菊苣与向日葵属间 杂种(C．intybus×H annus)、向日葵属内种间杂种(H annus×H annus 、H annus× giganteus 、H annus×H maximiliani )、莴苣属内种间杂种(L．tatarica×L．perennis )、菊蒿属内种问杂种(Tan acetum vulare× cinerariifolium )；采用高Ca+ 高pH 法度的聚乙二醇类媒剂技术，能够使水稻和大豆两大不同科的植物的原生质体发生融合。1999年，夏光敏等[22]用PEG法诱导普通小麦与紫外线照射的高冰草原生质体融合，产生了具有优良性状的F2代穗系。2001年Yue等[23]用PEG法将獐毛麦的耐盐性转移到普通小麦。2005年W