实验十一细菌质粒DNA的提取和纯化.docVIP

实验十一 细菌质粒DNA的提取和纯化 一、实验目的： 通过细菌质粒DNA的提取，掌握共价闭合环状DNA的提取方法。 二、实验原理： 1、细菌中有两种DNA，即染色体DNA和质粒DNA。 2、质粒DNA的提取方法有三种：碱裂解法、煮沸法和去污剂（如Triton和SDS）裂解法。 3、碱裂解法比较剧烈，可破坏碱基配对，使宿主细胞DNA变性，共价闭合环状DNA由于空间缠绕，两条链不会彻底分开。当外界条件到达复性条件时，质粒DNA的双链又迅速恢复原状，而较大的线性染色体DNA难以复性。 当菌体在NaOH和 SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。 纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。例如，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法，但这些方法相对昂贵或费时。对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在实验室中常用。 含有PMD19质粒的大肠杆菌（E. coli.）菌液 四、实验用具和药品： 实验用具：摇床、离心机、移液器及枪头、玻璃试管（15mL）及塞子、离心管（1.5mL）。 实验药品： 溶液Ⅰ（高压灭菌）： 50 mmol/L 葡萄糖 25 mmol/L Tris.Cl（pH8.0） 10 mmol/L EDTA（pH8.0） 溶液Ⅱ（现用现配）： 2 mol/L NaOH 10% SDS（十二烷基硫酸钠） NaOH： SDS：ddH2O=1:1:8 溶液Ⅲ： 5 mol/L乙酸钾 60mL 冰乙酸 11.5mL 水 28.5mL 五、实验步骤： （一）细菌繁殖 第1天晚上： 吸取含质粒的菌液2μL，转移入2mL LB（加入相应抗生素），37℃，过夜振荡（200r/min）培养。 （二）菌体收集 第2天早晨(时间:约2-3h左右)： 1、将过夜培养的菌体转入1.5mL离心管，5000r/min离心30sec；2、弃上清 碱裂解法提取质粒DNA 1、将上述沉淀重悬于100μL冰预冷的溶液Ⅰ中，剧烈震荡（须使沉淀完全分散） (葡萄糖：悬浮细胞；EDTA；抑制DNAase) 2、加入200μL溶液Ⅱ，盖紧管口，轻柔颠倒离心管5~10次，该过程应小于5min；（NaOH：溶解细胞膜，释放DNA；SDS） 3、加入150μL冰预冷的溶液Ⅲ，盖紧管口，温和地颠倒离心管5~10次，该过程大于5min；（SDS 反应生成PDSDNA也一起沉淀；冰乙酸 ：中和NaOH ） 4、10000r/min离心5min； 5、上清转移到另一新1.5mL离心管中； 6、加入2倍体积的无水乙醇，充分混匀，室温放置2min（若沉淀不充分，可加入1/10体积3mol/L的醋酸钠）； 7、10000r/min离心5min； 弃上清，干燥沉淀； 9、加TE溶解沉淀，保存。 六、实验作业： 思考本实验的关键步骤是什么？ 答：本实验的关键是溶液Ⅰ重悬须充分，溶液Ⅲ混合须温和。碱裂解法的关键是如何把握SDS-NaOH处理的时间。质粒制备过程中，如果质粒长时间暴露于NaOH, 质粒有可能不可逆变性，使得抽提质粒中有部分是变性质粒。这些变性质粒，不能酶切。所有一般情况下，SDS-KOH处理时间不能超过5分钟，最好在冰里处理，观察到液体变得清就可以加入中和液。 1、质粒的选取，尽量选择较小的松弛型质粒。 2、提取过程应尽量保持低温。 加入溶液2后不要剧烈振荡，只需轻轻颠倒几次离心管。 4、沉淀DNA通常使用冰乙醇，在低温条件下放置时间稍长可使DNA沉淀完全。沉淀DNA也可用异丙醇（一般使用等体积），且沉淀完全，速度快，但常把盐沉淀下来，所以多数还是用乙醇。 应用TE缓冲液在用苯酚、氯仿抽提时，以减少DNA的损失。 八、讨论与小结： 1.为什么用无水乙醇沉淀DNA？ 用无水乙醇沉淀DNA，这是实验中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的优点是可以任意比和水相混溶，乙醇与核酸不会起任何化学反应，对DNA很安全，因此是理想的沉淀剂。 DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会