实验报告二产酶微生物的分离、纯化与选育.docVIP

产酶微生物的分离、纯化与选育 实验目的 学习从自然界中分离蛋白酶产生菌并纯化； 通过实验观察紫外线和亚硝基胍等理化因素对微生物的诱变效应，并掌握基本方法； 实验原理 许多细菌和霉菌产生蛋白酶，细菌中的芽孢杆菌是常见的蛋白酶产生菌。本实验将土壤样品（或其他样品）悬液加热处理，杀死非芽孢细菌及其他微生物后进行划线分离得到芽孢杆菌，将其接种到酪蛋白平板进行培养，根据酪蛋白平板的水解圈作初筛。也可直接将细菌或霉菌接种到酪蛋白平板进行培养，分离筛选其他蛋白酶产生菌。 基因突变可分为自发突变和诱发突变。许多物理因素、化学因素和生物因素对微生物都有诱变作用，这些能使突变率提高到自发突变水平以上的因素称为诱变剂。 紫外线（UV）是一种最常用的物理诱变因素。它的主要作用是使DNA双链之间或同一条链上两个相邻的胸腺嘧啶间形成二聚体，阻碍双链的分开、复制和碱基的正常配对，从而引起突变。紫外线照射引起的DNA损伤，可由光复活酶的作用进行修复，使胸腺嘧啶二聚体解开恢复原状。因此，为了避免光复活，用紫外线照射处理以及处理后的操作应在红光下进行，并且照射处理后的微生物放在暗处培养。 试剂 距离地面十公分的土壤、酪素培养基 实验器材 恒温培养箱、恒温水浴锅、酒精灯、培养皿×8、试管×11、玻璃棒、移液管、量筒、三角瓶、烧杯、滴管、涂布器、血细胞计数板、移液枪、显微镜、紫外线等（15W）、磁力搅拌器、台式离心机、震荡混合器等 实验方法与步骤 酪素培养基的配置：牛肉膏3g、NaCl 5g，酪素 10g，琼脂 20g，水1000mL， pH 7.6-8.0。配制方法：称取酪素4g，先用少量2%NaOH润湿，玻璃棒搅动，再加适量的蒸馏水，在沸水浴中加热并搅拌，至完全溶解，补足水量至1000mL，加入其他成分，调整pH值，灭菌备用。 菌悬液的制备 取土壤20g，加水200ml，即梯度为10ˉ1的菌悬液，取1ml10ˉ1的菌悬液，加9ml的蒸馏水，即梯度为10ˉ2的菌悬液，按上述的方法步骤制作梯度为10ˉ3、10ˉ4、10ˉ5的菌悬液。将制作好的菌悬液做好标记，至温度为80℃的水浴锅热处理30min。 3、接种与培养：在超净台将上述经过热处理菌悬液按下表接种 接种梯度 10ˉ1 10ˉ2 10ˉ3 10ˉ4 10ˉ5 培养皿接种个数 1 2 2 2 1 菌悬液接种滴数 2 2 2 2 2 用涂布器涂均匀。放在温度为32℃恒温培养箱倒置培养48h。 4、菌种的选育：菌悬液的制备① 取培养48小时生长旺盛的出发菌株斜面1支，取2环接入10 ml 无菌生理盐水菌中，倒入盛有玻璃珠的小三角烧瓶中，振荡30分钟，以打碎菌块。② 将上述菌液离心（3000 r/min，离心15分钟），弃去上清液，将菌体用无菌生理盐水洗涤2-3次，最后制成菌悬液。③ 用显微镜直接计数法计数，调整细胞浓度为每毫升108个。平板制作：将淀粉琼脂培养基溶化后，冷至55℃左右时倒平板27套，凝固后待用。紫外线处理：① 将紫外线灯开关打开，预热约20分钟。② 取直径6cm无菌平皿2套，分别加入上述调整好细胞浓度的菌悬液3ml，并放入一根无菌搅拌棒于平皿中。③ 将上述2套平皿先后置于磁力搅拌器上，打开皿盖，在距离为30cm，功率为15W的紫外线灯下分别搅拌照射1分钟和3分钟。盖上皿盖，关闭紫外灯。稀释：在红灯下，将上述经诱变处理的菌悬液以10倍稀释法稀释成10-1-10-6（具体可按估计的存活率进行稀释）。涂平板：取10-4、10-5、10-6三个稀释度涂平板，每个稀释度涂平板3只，每只平板加稀释菌液0.1ml，用无菌玻璃刮棒涂匀。以同样操作，取未经紫外线处理的菌稀释液涂平板作对照。培养：将上述涂匀的平板，用报纸包好，置37℃培养48小时。注意每个平皿背面要标明处理时间和稀释度。计数：将培养48小时后的平板取出进行细菌计数，根据对照平板上菌落数，计算出每毫升菌液中的活菌数。同样计算出紫外线处理1分钟、3分钟后的存活细胞数及其致死率。 % ×100% 观察诱变效应：将细胞计数后的平板，分别向菌落数在5-6个左右的平板内加碘液数滴，在菌落周围将出现透明圈。分别测量透明圈直径与菌落直径并计算其比值（HC值）。与对照平板进行比较，根据结果，说明诱变效应。并选取HC比值大的菌落移接到试管斜面上培养。此斜面可作复筛用。 数据处理 产酶微生物的分离与纯化结果：五种梯度的培养基都长有菌种，其中以10ˉ5梯度的培养基中菌种长势最佳，菌种成白色，大多为单菌落，并且在单菌落外形成了透明的水解圈。 紫外诱变结果 表2 紫外线诱变结果 诱变剂 处理时间（min） 平均菌落（数/皿） 稀释倍数 10ˉ4 10ˉ5 10ˉ6 存活率% 致死率% 紫外线 （UV） 0（对照）