山大生化实验报告实验一、三酵母RNA的提取和含量测定.docVIP

酵母RNA的提取和含量测定 姓名：周超 学号：201100140067 班级：11级生命基地 同组者：刘炳煜 时间：2011年3月26日 【实验目的】 掌握稀间法提取酵母RNA的原理和方法 了解测量核算浓度的不同方法的原理 掌握紫外吸收法测定核酸浓度的原理和技术 学会使用紫外分光光度计 学会使用离心机 【实验原理】 酵母RNA提取的原理： 酵母核酸中RNA含量较多，DNA则少与2% RNA可溶于碱性溶液，当碱被中和后，可加入乙醇使其沉淀，由此可制得粗RNA制品。 用碱提取的RNA有不同程度的降解。 紫外吸收法测RNA含量的原理： （1）核酸具有吸收紫外线的性质，在波长260nm处有最大吸收，且在一定浓度范围内光吸收值与浓度成正比（5-45ug/ml），符合朗伯-比尔定律。 （2）优点：操作简单，样品用量少，不用显色，测完后样品可以继续使用。 （3）缺点：当有大分子物质存在时，也会有一定的吸收，会影响测量精确度。 【实验试剂】 提取试剂：0.2% NaOH溶液 酸性乙醇：5ml浓HCl加入到500ml95%乙醇中混匀 95%乙醇 无水乙醇 含量测定试剂：0.2% NaOH溶液 pH试纸（1-14） 标准核酸：200ug/ml 待测样品核酸 【实验步骤】 酵母RNA的提取： 将4g干酵母粉放入200ml锥形瓶中，加入40ml 0.2%的NaOH溶液混匀。 沸水浴30min，然后用流水冷却 4000转/分 离心 15秒，保留上清液 在上清液中加入40ml酸性乙醇，边加边搅拌，静置5分钟左右，再4000转/分离心5分钟，保留沉淀 用20ml 95%乙醇分两次洗涤沉淀，每次洗后3000转/分离心5分钟 用20ml无水乙醇分两次洗涤，每次洗后3000转/分离心5分钟 收集沉淀于滤纸上备用。 RNA含量的测定： 准确称取0.2-0.25g（因提取到的RNA粗品量太少，本次实验使用的RNA量仅为0.1910g）样品核酸，加2ml 0.2% NaOH溶液和1ml水溶解，调成糊状 再加入50ml左右的水溶解，边溶解边转移到100ml烧杯中，用0.2% NaOH调至中性，定容至100ml 再分3次取2.5ml定容至100ml备用，做平行实验 取200ug/ml的标准RNA 20ml，加水定容至100ml，得到40ug/ml的RNA备用 再将40ug/ml的RNA按表一加样稀释，得到5ug/ml、10 ug/ml、20 ug/ml、30 ug/ml、40 ug/ml的标准溶液 用紫外分光光度计测量吸光值，绘制标准曲线，计算样品纯度。 【实验结果】 管号 标准曲线 样品 0 1 2 3 4 5 6 7 8 标准RNA （40ug/ml）/ml 0 2.5 5 10 15 20 / / / 水/ml 20 17.5 15 10 5 0 / / / 标准RNA浓度/（ug/ml） 0 5 10 20 30 40 / / / OD值 0 0.097 0.191 0.383 0.621 0.767 0.638 0.648 0.638 表一 图一 标准曲线 计算： 三次平行实验平均OD值= 0.6413，根据标准曲线，得到稀释后的RNA浓度为32.719ug/ml，则样品RNA的纯度为（32.719*40*100）/（0.1910*10-6）=0.6852 【思考讨论】 实验结果分析： 本次实验最终的测定结果为，RNA的纯度为68.52%，造成这个结果的原因： 用稀碱法提取的RNA有不同程度的降解 人在操作过程中，会呼出少量的RNA酶，也会降解样品RNA，导致纯度下降。 提取的样品中有细胞内含物，也会对纯度有影响。 注意事项： （1）离心机使用的注意事项：离心时，离心管要平衡对称放置，既要位置对称，又要重量平衡。否则会造成离心机损坏。 （2）提取RNA时，用酒精沉淀时，一定要充分，边加酒精边搅拌上清液。 （3）提取RNA时，用酒精洗涤沉淀时，一定要把酒精与沉淀混匀，这样做有利于增高提取浓度。 （4）RNA含量测定中，若RNA样品少与2.0g时，取2.5ml的母液，定容至100ml；若RNA样品量为2.0-2.5g，则取2.0ml的母液，定容至100ml，这样稀释之后，可以保证测量液的吸光值在标准曲线之内。 （5）使用紫外分光光度计测量RNA含量时，一定要注意做平行实验，即分别取3次2.0ml的母液，分别定容至100ml，制成3个测量液，切记平行实验不是把相同的测量液测三次。