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生物化学实验指导 李 伟 编 大连水产学院 2005目 录 理 论 部 分 一 总论……………………………………………………….5 生化实验技术发展简史…………………………………. 5 实验室规则………………………………………………..6 实验记录及实验报告……………………………………..7 实验室基本操作…………………………………………..8 缓冲液与pH值测定………………………………………9 二 生物大分子制备和检测技术……………………………17 生物大分子的制备……………………………………….17 层析技术………………………………………………….21 电泳技术………………………………………………….30 离心分离技术…………………………………………….32 分光光度技术…………………………………………….34 放射性同位素检测技术………………………………….37 实 验 部 分 第一部分 糖…………………………………………………42 实验一 可溶性糖含量的测定………………………………42 第二部分 蛋白质……………………………………………45 实验二 血清蛋白的盐析及清/球比值的测定……………….45 实验三 凝胶过滤层析………………………………………..49 实验四 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS)…………………54 实验五 蛋白质及肽的N末端氨基酸测定………………….60 第三部分 酶…………………………………………………..65 实验六 乳酸脱氢酶粗提液的制备及活力测定……………..65 实验七 亲和层析纯化乳酸脱氢酶…………………………..69 实验八 碱性磷酸酶的Km值测定…………………………..75 实验九 pH对酶促反应速度的影响…………………………79 实验十 温度对酶促反应速度的影响………………………..82 第三部分 核酸………………………………………………..84 实验十一 动物肝脏RNA的制备及琼脂糖电泳的鉴定……84 实验十二 二苯胺显色法测定DNA的含量…………………89  一 总论 生命科学在20世纪具有惊人的发展，其中生物化学与分子生物学技术的进展尤为迅速，它极大地推动了生命科学的发展，并将成为21世纪带头学科。该学科的发展与实验技术息息相关，每一种新的生化物质的发现与研究都离不开实验技术，实验技术每一次新的发明均大大推动了生物化学研究的进展，因此，实验部分在生物化学这门学科学习中占有重要地位。它也是生物技术专业学生必修的一门基础实验课程，对于每一位生物技术专业学生来说，学习并掌握各种生物化学实验技术是极为重要的，它在生命科学基础研究领域具有广泛应用价值。 1．生物化学实验技术发展简史 20世纪20年代，微量分析技术的发展和超离心技术的建立，开创了生化物质离心分离的先河，同时，准确测定了如血红蛋白等复杂蛋白质的分子质量。30年代，电子显微镜技术打开了微观世界，使我们能够看到细胞内以及生物大分子的内部结构。40年代至70年代期间，层析技术和电泳技术兴起，以及同位素示踪技术、各种光谱技术应用，尤其是Watson和Crick利用上述技术提出并证实了DNA双螺旋结构模型，这些研究成果开创了生命科学的历史新纪元。20世纪70年代，基因工程技术取得了突破性的进展，Arber、Smith和Nathans 3个小组发现并纯化了限制性内切酶。1972年，美国斯坦福大学的Berg等人首次使用限制性内切酶切割了DNA分子，并实现了DNA分子的重组。第二年，Cohen等人第一次成功进行了DNA重组体的转化技术，与此同时，各种仪器分析手段进一步发展，研制成功了DNA测序仪、DNA合成仪等。从此，生物化学进入了蓬勃发展的时期，即进入了分子生物学时代。1985年，PCR（polymerase chain reaction）即聚合酶链式反应的DNA扩增技术，另外，近年来发展起来的RNAi(RNA interfere)技术,基因芯片技术，染色质免疫共沉淀技术（CHIP）等均推动了生命科学研究的发展，对于生物化学和分子生物学研究工作具有跨时代意义。 2．实验室规则 (1)实验前必须认真预习实验内容，明确本次实验目的，掌握实验原理，操作关键步骤及注意事项，写好实验预习报告。 (2)实验时自觉遵守实验室纪律，保持室内安静。 (3)实验过程中要听从教师指导，认真按照实验步骤和操作规程进行实验，注意观察实验过程中出现的现象和结果，并认真进行实验记录，对实验结果展开讨论，结果不良时，必须重做。实验完毕及时整理数据，按时上交实验报告。 (4)实验中，将移液枪、吸量管、药品等用完后放回原处，实验台面、称量台、药品架、水池以及各种实验仪器内外都必须保持清洁整齐，严禁瓶盖及药勺混杂，切勿使药品(尤其足NaOH)洒落在天平和