玻璃微电极技术及在植物胞内测量中应用.docVIP

玻璃微电极技术及其在植物胞内测量中的应用 姓名：汪晓丽 学号：4034 导师：封克 教授 扬州大学环境科学与工程学院，扬州 225009 1 玻璃微电极技术简介 1.1 玻璃微电极及离子选择性玻璃微电极 微电极是指尖端很细的电极探针。它可以用于胞内测量[1~8]，也可以用于胞外测量[9]。对于细胞内测量，通常采用玻璃微电极，内部灌注盐溶液，与电极夹持器的金属接触点之间构成盐桥，从而构成电路的一部分。玻璃微电极尖端用特制仪器拉制得非常细（直径一般不超过1μm），这样细的针尖刺入植物细胞膜后，质膜很快就能够在针尖刺入处愈合，从而避免细胞膜受到破坏，且容易获得一个比较稳定的膜电势差。 最简单的玻璃微电极可用来测量细胞膜内外的电势差。这时需要两个电极，一个是测量电极，尖端细小，插入细胞内，另一个是参比电极，尖端稍大，安放在细胞外。两电极间的电势差由静电计测量，经放大器放大后由记录仪记录（图1）。 离子选择性玻璃微电极是指在尖端有一层离子选择性液膜的玻璃微电极。它对跨膜电势差和相应的敏感离子都有响应。胞内测量时，可同时测量跨膜电势差和相应离子的活度（图2）。采用离子选择性微电极进行胞内测量时主要的优点是：（1）原位测定，不会对细胞造成伤害；（2）可同时测定单个细胞的跨膜电势梯度和化学势梯度；（3）可用于测定多种离子；（4）与其它胞内测量方法相比，相对比较便宜。正是由于离子选择性微电极的这些优点，使得离子选择性电极成为测量单个细胞内离子的活度的唯一方法。采用离子选择性微电极进行胞内测量时最大的缺点是：只能测量细胞内单点的离子活度，因而在细胞内离子浓度相差很大时不能提供更为完全的信息。 1.2 离子选择性玻璃微电极技术 离子选择性玻璃微电极的制作是微电极技术的一个关键步骤，大体可分为拉制玻璃针、硅化玻璃管内壁、灌注离子选择性液膜、校正等几个步骤[10]。玻璃微电极通常采用硬质玻璃（如硼硅玻璃、铝硅玻璃）管经专门的微电极拉制仪拉制而成。硅化玻璃管内壁是为了在玻璃管内壁与离子选择性液膜之间形成高阻封接的牢固防水层。离子选择性液膜原液可以自己配制或直接购买商品化的，灌注到微电极的尖端后形成一层对于特定敏感离子有响应的选择性液膜。校正离子选择性玻璃微电极时通常采用具有不同活度的一系列标准溶液。为了尽量接近细胞内的情况，需要对标准溶液的离子强度、pH等进行调节，并且其中往往还要加入少量的干扰离子。 玻璃微电极制作成功后，即可用于进行植物细胞的胞内测量。所采用的仪器设备主要有：显微镜、微操纵仪、放大器、数据采集系统、防震台和屏蔽罩等。由于生物电信号的电压极小，电阻大，所以放大器必须具备高灵敏度、高输入阻抗、高辨差率等特点，才能准确记录到电信号的微弱变化。 2 玻璃微电极技术在植物细胞胞内测量中的应用 2.1 研究离子跨膜转运机制 细胞的膜电位是由细胞膜对特异离子的相对透性和离子的跨膜浓度梯度决定的，一般为负值。任何离子或分子在跨膜转运时，如果有电荷的移动，就会使跨膜电势差（膜电位）发生变化。当内向电流（阳离子内流或阴离子外流）大于外向电流（阳离子外流或阴离子内流）时，膜被去极化，即膜电位向负值减少的方向变化；当外向电流大于内向电流时，膜被超极化，即膜电位向膜电位负值增大的方向变化。当然，生物膜中膜电位的变动是很有限的，因为：①膜电位为负值，使得一些溶质（例如：NH4+、糖类、氨基酸等）能够逆浓度梯度在电场驱动下进行跨膜运输；②膜电位需控制在一定范围内才能使得H+-ATP酶能够正常地运转，否则会造成膜的电损伤；③膜电位在细胞信号传导中起着重要的作用，例如，当一些效应物引起膜电位去极化时，触发Ca2+通道的激活，使得胞内的Ca2+浓度发生变化而导致信号进一步传导[11]。膜电位高低受到细胞外和细胞内诸多因子的影响，例如pH、细胞质ATP浓度、离子组成等。膜电位可用于表征细胞健康状况和能量状况，因为一旦细胞膜受到损伤，或者细胞内的ATP库被耗竭了，膜电位就会有大幅度的改变[12]。 由于离子选择性电极可同时测量跨细胞膜的电势差和膜内特定离子的活度，因而可根据Nernst方程来计算特定离子跨膜运输的平衡浓度，并判断其是主动运输还是被动运输。假如测得液泡膜电势差为10~20mV，利用Nernst方程可计算出通过被动运输进入液泡膜的NO3-平衡浓度可达6~9 mol L-1。但是，实际上液泡中的NO3-浓度要高得多，因此NO3-从细胞质中进入液泡的机制主要靠主动运输。 NH4+、NO3-、SO42-、H2PO4-、氨基酸、蔗糖等都是细胞内代谢过程的底物，它们通过跨膜运输进入细胞内的代谢库，因而其在细胞内的浓度（活度）及细胞膜上特定转运体的活性就体现了细胞内相应的代谢过程的活性[12]。例如，通过在外部溶液中加入NO3-和NH4+，诱导细胞的膜电位发生变化，可