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真菌漆酶工程及其在有机合成中的应用 李飞 夏文静 （南京师范大学泰州学院 江苏泰州 225300） 1 漆酶的性质 1.1 生化特征 漆酶是含有四个铜原子并与三个氧化还原位点（T1，T2和T3）相结合的典型单体胞外酶。T1型Cu在氧化还原测试中呈现绿色，与还原性底物的氧化作用有关。三核簇（含有一个T2型Cu和两个T3型Cu）与T1位点相距12 ?，分子氧在此处被还原成水。 在不同的培养条件下，真菌合成漆酶会出现不同的同工酶。大多数漆酶都是单体蛋白，不同来源的漆酶其分子被不同程度的糖基化，平均分子量在60-70kDa，碳水化合物含量在10-20%，这有助于漆酶的高稳定性。通常与酶通过共价键相连的碳水化合物包括甘露糖，N-乙酰葡糖胺和半乳糖。氨基酸链含有包括N-末端分泌肽在内大约含有520-550个氨基酸。 1.2 生物学功能与工业应用 2 漆酶介体体系 漆酶与小分子如ABTS和HBT的结合不仅会具有更强的催化氧化还原能力，而且会扩大漆酶对底物的作用范围，并能够氧化氧化还原势能比其更高的化合物。此外，小分子介质作为电子载体，能够氧化木质素，纤维素或淀粉等生物高分子。由于氧化还原介质的作用，克服了阻碍酶与多聚物间的直接影响的空间结构的影响。 漆酶介体体系给生物技术和环境应用带来较高的效率。选择合适的介质在生物转化应用中是至关重要的。由于漆酶介体体系中底物通过不同的机制发生氧化，因此使用相同的前体时，不同介质的选择可能导致不同的终产物。介体自由基根据化合物的结构和有效的氧化还原势能执行具体的氧化反应。 尽管漆酶介体体系有较大的优势，但是以下两点阻碍了介质的使用:介体价格昂贵并会产生有毒的衍生物。在某些情况下，由于介质自由基的存在，漆酶在氧化介质时是不显示活性的。或者后者转化为无活性的化合物并失去充当介质的能力。因此寻找一种廉价高效、应用面广的介体将是LMS系统处理技术得以推广应用的关键。研究表明，一些真菌能自然合成天然的介体。例如苯酚，苯胺，4-对羟甲基苯甲酸，4-羟基苯甲基醇。最近，人们证明来自木质素降解过程中的酚类化合物（如乙酰丁香酮，丁香醛，香草醛，香草乙酮，阿魏酸，p-香豆酸）在染料脱色，多环芳烃的去除，纸浆漂白和沥青的去除中是高效的漆酶天然介体。 3 漆酶工程 迄今为止，很少有报道关于活性漆酶的晶体结构。根据已报道的漆酶结构，过去十年研究对具有催化活性的铜离子周围一些残基进行定点突变，以确定催化活性参数和真菌漆酶势能。收集在T1铜原子中心发生结构混乱的突变体是这些结构功能综合研究的结果之一。 在没有足够结构信息的情况下，分子定向进化能克服许多合理设计中的限制因素，并能显著增强有针对性的特征，例如耐高温和有机溶剂，提高催化活性及专一性等。Arnold等首次成功定向漆酶进化，通过定向进化在毕赤酵母中完成了耐热性漆酶的功能性表达：经过10轮实验室进化和筛选，总体酶活提高了170倍并具有更好的耐热性。 大多数漆酶在有机合成中催化转化必须发生在有机溶剂中。漆酶在高浓度有机助溶剂中会失去活性。Adinarayana Kunamneni等经过5轮定向进化在毕赤酵母中表达出一种耐热性漆酶，并能耐高浓度的有机助溶剂。这种进化的漆酶突变体能够抵抗大量与生物技术有关的浓度高达50%的可溶性助溶剂。固有的电化学漆酶特性如T1位和T2/T3位处的氧化还原势能，催化铜原子的几何和电子结构在体外进化过程中明显改变。通过形成更多的静电和氢键，一些突变体在蛋白质表面形成更加稳定的漆酶，此外，在转录翻译过程中，在加工区域突变体蛋白质折叠似乎被修饰。 除了随机突变和DNA重组外，利用通过饱和突变构建组合库和蛋白质结构的半经验研究也被成功运用。这一技术普遍运用在提高“热点”残基处酶学特性。它还可用来同时突变一些密码子，使残基进行所有可能的组合，通过评估获得最佳的相互作用和协同效应。 最近对毕赤酵母中表达的耐热性漆酶变体T2研究表明，将重组饱和突变体应用到L513和S510残基，突变体比野生型菌株提高3倍利用率，包括一个有益突变（TCGS510GGGG），由于它取决于两个连续的核苷酸的改变，该突变体不能通过传统的易错PCR技术而获得。 4 漆酶在有机合成中的应用 4.1 漆酶的酶促聚合反应和聚合功能 漆酶或漆酶介体体系能直接产生聚合物使得通过漆酶酶促聚合反应引起广泛的关注。例如，运用漆酶的聚合能力，通过邻苯二酚单体合成聚合邻苯二酚。通过漆酶催化反应生产惰性酚类聚合物等。通过漆酶反应酶法制备聚合多酚由于无毒安全可以替代通常以甲醛为基础合成的化合物。 研究表明，漆酶诱导一种新型的4-羟甲基苯甲酸衍生物，3，5-二甲基-4-羟基苯甲酸和3，5-二甲氧基-4-羟基苯甲酸氧化聚合物。聚合作用参与单体中二氧化碳和氢气的消除，使得多酚氧化酶衍生物分子量高达1.8×104。 已经证