FISH技术的探针要求必须具有较好的特异性.docVIP

F ISH 技术的探针要求必须具有较好的特异性、灵敏性和良好的组织渗透性。根据需要合成的 DNA或 RNA寡核苷酸探针可识别靶序列内一个碱基的变化, 能够用酶学或化学方法进行非放射性标记。F ISH 技术不仅能提供静止的实验结果, 还可以动态地观察流动水体中的微生物种群变化, 因此 FISH 技术被用于监测环境中微生物在时间或空间上的动态变化, 以帮助人们理解环境中微生物种群的组成和生长动力学。 FISH 的首次应用是在 1980 年，Bauman [1]等用荧光染料直接标记探针 RNA 的 3端，检测到了特异的 DNA，1988 年 Giovnanoni [2]等将 FISH 技术引进到了细菌学，他第一次用放射性同位素标记已知的 rRNA 寡核苷酸探针进行细菌的显微镜观察，随后该技术在系统发育微生物学、微生物生态学、微生物的诊断和周围环境的研究中得到了迅速的发展。目前在单一样品 ( 如纯培养菌种) 检测中的应用已十分普遍，准确度较高［3，4］，但在复杂样品( 如活性污泥) 检测中的应用仍不成熟，易受到样品中所含杂质的影响，出现假阳性或假阴性信号［5］。本文采用细菌通用探针 EUB338，结合 DAPI全细胞染色技术，探讨了针对活性污泥样品的荧光原位杂交实验方法，并对自发荧光和真实信号的辨别要点进行了讨论。 [7] Bauman J G J ，Wiegant J ，Van Duijn P . Cytochemical hybridization with fluorochromelabeled RNA. Ⅲ. Increased sensitivity by the use of anti-fluorescein antibodies［J］. Histochemistry，1981，73（4）: 181-193 ［8］ Giovannoni S J ，DeLong E F ，Olsen G J ，Pace N R . Phylogenetic group-specific oligodeoxynucleotide Probes for identification of single microbial cells［J］. Bacteriol，1988，170（21）: 720-726. ［3］ 万春黎 . 同步脱氮脱硫工艺生物强化及种群动态分析初探［M］. 哈尔滨:哈尔滨工业大学，2006.123-127 ［4］ 任艳红 . 降解五氯酚厌氧生物反应器微生物种群结构的分子特性研究［M］. 浙江: 浙江大学，2004.342-145 ［5］ 王明义，袁晓燕，宋雪珍，等 . 荧光原位杂交法在检测硫酸盐还原菌中的应用［J］.中国现代医学杂志，2008，18( 3) :302-304. 荧光原位杂交技术结合分子生物学的精确性和显微镜的可视性, 可进行微生物的空间分布情况分析和特征性微生物的鉴定与定量分析。1989年, DeLong首次将荧光标记寡核苷酸探针应用于检测单个微生物细胞[ 3], 开创了应用于微生物生态学的先河。由于该法操作容易、安全、检测迅速, 目前已广泛应用于环境微生物生态学[ 4, 5]和食品学[ 6]等领域, 成为研究微生物群落最具生命力的技术之一。 [ 1] Choi B. K . , Past er B. J . , D ew hi rst F. E . , 等 . Diversity of cultivable and uncultivable oral spirochetes f rom a patient with severe destructive periodontitis [ J] . Inf ect . Immun . ,1994, 62( 5) : 1 889-1 895. [ 2] Wagner M . , A m ann R. , Lem mer H . , et a l . Probing activated sludge with proteobact eria- specific oligonucl eotides :in adequacy of culture-dependent methods for describing microbial community structure [ J ] . A ppl. Environ. Microbiol. , 1993, 59( 5) : 1 520-1 525. [ 3] D eLong E. F. , Wickham G . S. , Pace N . R. . Phyl ogenetic stains : ribosomal RNA based probes for the identif ication of single mi