膀胱癌血清及尿液代组学研究.docVIP

膀胱癌血清及尿液代谢组学研究 陈永婧1 王小华1 黄真真1 林琳1 高瑶1 朱尔一1 邢金春2 郑嘉欣2 杭纬1* 1（） 2（） 摘　要　electrospray ionization mass spectrometry，LC-ESI/MS）联用技术对20名膀胱患者与24名正常人的血清和尿液进行研究。多变量统计分析结果表明，膀胱癌患者和正常人聚类明显，血清和尿液中分别发现13个潜在标志物。其中，（2E，6E，8E）-二十二碳三烯-1-醇、7-（（1S，2S）-2-（庚胺）环己基）庚酸和（11E，14E，17E）-三烯-二十碳-1-醇首次在血清中发现，有潜力成为膀胱癌诊断标志物。液质联用结合多变量分析的代谢组学研究技术在膀胱癌诊断中展现出巨大潜力。 关键词　 1 引 言[1-3]。基于BC不同阶段和临床表现，对于早期患者，其成活率高达约95%；然而对于晚期患者成活率降低到50%左右[4]。因此，早期诊断、治疗会大大提高患者的成活率。代谢组学在发现潜在生物标志物和改善膀胱癌早期诊断方面有独特的前景。它借助先进的分析仪器和统计工具对多种疾病进行标志物检测和研究，但用代谢组学方法研究膀胱癌的报道相对少见[5-7]。 在膀胱癌的研究中，尿液由于其特殊性，一直被作为首选的检测样品。目前，报道的潜在生物标志物大多来源于尿液[8]。血清中几乎涵盖了身体各个器官和组织的代谢物，所以应重点筛查。本文同时对膀胱癌血清和尿液两种样品进行研究，比起单一研究尿液样品，扩大了生物标志物的筛选范围。此外，反相色谱（Reversed phase liquid chromatography，RPLC）和亲水作用色谱(Hydrophilic interaction liquid chromatography，HILIC)联合使用将进一步增加筛选的代谢物数目及种类[9, 10]。 2　 实验部分 2.1仪器与试剂 1 样品统计信息 Table 1 Demographic data 样本特征Characteristics 膀胱癌患者BC patients 正常人Healthy controls 样本数目No. of subjects 20 24 年龄（平均值，范围）Age (average, range) 60, 45-74 57, 41-77 男性Male 15 18 女性Female 5 6 人种Race 中国人Chinese 中国人Chinese 2.2 实验方法2.2.1 样品前处理 150 μL血清中加入事先预冷的甲醇450 μL，漩涡混合，沉淀蛋白；静置于-20°C ，10 min；4°C，12,000 ×g离心10 min，取上清滤膜（0.22 μm）过滤。200 μL尿液中加入800 μL超纯水，用于RPLC-MS分析。100 μL 尿液中加入400 μL乙腈用于HILIC-MS分析，用乙腈稀释的目的在于避免产生“water plug”效应，以减少对色谱分离的影响[11]。从处理后每一例样品中取15 μL合并组成质量控制（Quality control，QC）样品。每隔五个样品分析QC和空白，以检验分析方法的重现性和色谱上样量。 2.2.2 色谱分析方法 RPLC 和HILIC分析均采用Ultimate-3000 高效液相色谱系统（Dionex，USA）。Kinetex C18（2.1 × 100 mm × 2.6 μm，Phenomenex，USA）用于反相分离。反相色谱流动相A：0.1%甲酸（v/v）溶液；流动相B：含0.1%甲酸（v/v）乙腈溶液；RPLC流速：300 μL/min。亲水分离，采用XBridgeTM HILIC 色谱柱（2.1 × 150 mm × 3.5 μm，Waters，USA）。流动相A：含0.1%甲酸（v/v）及10 mmol/L醋酸铵的水溶液；流动相B：含0.1%甲酸（v/v）乙腈溶液；HILIC流速：200 μL/min。在整个色谱分析过程中，血清上样量为15 μL，尿液上样量为20 μL。RPLC 和 HILIC色谱条件均经过优化，优化结果如表2所示。 表2 反相和亲水模式下色谱分离条件 Table 2 LC parameters for RP and HILIC separations 血清Serum 尿液Urine 反相液相色RPLC 亲水作用色谱HILIC 反相液相色RPLC 亲水作用色谱HILIC Time, min B% Time, min B% Time, min B% Time, min B% 0 15 0 95 0 15 0 95 2 15 5 95 4 15 3 95 24 95 22 45 14 45 18 4