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一、聚合酶链式反应（PCR） 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）：是一种体外酶促扩增特定DNA片段的技术，即将微量的DNA进行成倍扩增。 二、典型的PCR包括许多循环，每个循环包括三个步骤： （1）高温变性模板使之成为单链，95℃约1min； （2）低温使引物与单链模板退火（复性）55℃左右； （3）中温使引物沿模板延伸，75℃左右 每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。 耐热DNA聚合酶-Taq酶 耐热DNA聚合酶-Taq酶的发现对于PCR的应用有里程碑的意义，该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本。 三、PCR反应体系： 反应缓冲液（10×PCR Buffer） 脱氧核苷三磷酸底物（dNTP mix） 耐热DNA聚合酶（Taq酶，可耐受95度左右高温） 寡聚核苷酸引物（Primer1，Primer2，约20个核苷酸，与目的DNA两侧的区域互补） 靶序列（DNA模板）五部分组成。 我的实验： 1.得到基因全长序列 2.设计引物 引物设计软件 Primer Premier5.0 “Premier”的主要功能分四大块，其中有三种功能比较常用，即引物设计、限制性内切酶位点分析和DNA 基元(motif)查找。“Premier”还具有同源性分析功能，但并非其特长，在此略过。此外，该软件还有一些特殊功能，其中最重要的是设计简并引物，另外还有序列“朗读”、DNA 与蛋白序列的互换等。 引物设计要求： 1.引物长度：15-30bp，常用为20-24bp左右。可以保证基因的特异性 。 2.GC含量，一般引物序列中G+C含量一般为40%~60%，一对引物的GC含量和Tm值应该协调。 3.引物自身及引物之间不应存在互补序列 引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构(Hairpin)使引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。 4.Tm=58-60度 退火温度决定了基因扩增的特异性，如温度太高，则有可能得不到目的基因，若太低，则可以出现多条杂带。 5.引物的5‘端可以修饰。如附加限制酶位点，引入突变位点，用生物素、荧光物质、地高辛标记，加入其它短序列，包括起始密码子、终止密码子等。 6.碱基础随机分布 引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。 7. 密码子的简并 如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增特异性与效率。 设计好引物送到公司合成 一般在3-5天引物就可以合成 稀释引物 稀释引物，一般先配成储存液（100μM），再吸取一部分配成工作液（10μM），分装成小管。这样的好处是引物不容易降解。最好多分装些，每管用尽量少的次数，是避免污染导致实验失败。 引物的保存 （1）未稀释的引物干粉很稳定，放置于-20℃可 以保存1年。 （2）储存液（100μM）放置于-20℃也可以长期保存. （3）工作液（10μM）短期内经常使用（1-2 周），可放置在4℃下保存，长期保存请放置于-20℃。 PCR反应体系： ddH2O: 23.5μl Bufffer: 10μl dNTP(2.5mM) : 4μl Primer1(2μM) : 5μl Primer2(2μM) : 5μl 酶: 0.5μl 模板： 2μl 总体系： 50μl PCR操作中需注意的事项： 1 尽量保证核酸纯净并控制浓度：浓度太低模板量不足，浓度太高杂质含量也就高，易影响Taq酶活性。 2 操作尽量在冰上 。 3.避免交叉污染——勤换枪头和高压枪头和PCR管。 4.引物和模板和体系所加的比例要合适，模板过量会抑制体系的反应。 5.吸取试剂前不必每次都混匀，离心是为了把粘在壁上和盖上的试剂离下来。不离也没关系，可以直接用枪头吸。但是配制的时候需要充分混匀，比如溶解引物，需要先混匀再分装。 PCR仪反应程序： 98℃ 1min 98℃ 10S Tm 10S 72℃ t（1min扩增1Kb） 72℃ 5min 补充延伸 如果是循环结束后的5～10分钟终延伸，它的作用实际上是起到一个补偿作用，有时候你循环过程中的