油田土壤中脱除有机硫菌株的分离与鉴定.docVIP

油田土壤中脱除有机硫菌株的分离与鉴定 杨 宇1, 2，刁梦雪1, 2，师舞阳1, 2，邹俐宏1, 2，邱冠周1, 2 * 1. 中南大学资源加工与生物工程实验室，湖南 长沙 4100832. 生物冶金教育部重点实验室，湖南 长沙 410083 从中原油田采集的土壤样品中分离得到有脱除有机硫（二苯并噻吩）能力的菌株ZYX。该菌株为革兰氏染色阳性，无运动性，专性需氧，固体培养基上菌落为浅黄色、圆形、湿润、有光泽、边缘整齐，培养2 d后平均直径为1.5 mm，在液体培养基中有明显的杆－球状生长周期。对该菌株的16S rDNA的全序列测序，并进行DNA同源性分析，发现它与与Arthrobacter sp. P2的同源性为99.53%，其主要形态及生理生化特征也与Arthrobacter属相符。实验表明，最佳生长所需的DBT浓度是0.01 g·L-1,最适pH值为7.0，最佳碳源和氮源分别为甘油和谷氨酰氨。 节杆菌Arthrobacter；16S rDNA；二苯并噻吩；生物脱硫；分离与鉴定 A 文章编号：1672-2175（2006）05-1009-05工业上使用的化石燃料多为原油和煤炭，其中均含杂质硫，在燃烧过程中将排放酸性气体SO2，释放到空气中即造成污染，严重时形成酸雨。高硫化石燃料必须预先经过脱硫处理才能进一步使用。原油中的硫含量相差很大，其中主要是有机硫，包括硫醇、硫化物及含硫的杂环化合物如噻吩等。煤炭中的硫也以有机和无机两种形式存在，有硫化物型、硫醇型、噻吩型等，共分为13 类，包括176 种不同结构，其中噻吩含量最多[1]。煤炭中有机硫和无机硫在数量上差不多。无机硫主要是硫化物和硫酸盐，硫化物大部分是以黄铁矿形式存在[2]。 目前虽然已有多种方法脱除化石燃料中的硫，但是传统的物理分离方法只能脱除无机硫，而化学方法需在高温高压、催化加氢等条件下进行，成本和操作费用很高[3]。例如工业上主要采用的加氢脱硫法（hydrodesulfurization，HDS），虽然能有效地脱除油中的无机硫和部分有机硫，但是对二苯并噻吩（dibenzothiophene，DBT）的脱除效率极低[4]。相比之下，生物催化法脱硫（biodesulfurization，BDS）更为经济，在常温下即可进行，并且具有高专一性。自然界存在的某些微生物，已经具备了多种必要的生物化学策略来应对有机硫或无机硫对自身的毒害作用。微生物脱除有机硫也正是以DBT作为有机硫模式化合物进行研究。 现在已经发现一些微生物如红球菌属（Rhodococcus）、节杆菌属（Arthrobacter）、棒杆菌属（Corynebacterium）和芽孢杆菌属（Bacillus）等, 能够沿着硫专一途径（sulfur-specifi pathway）降解DBT, 它们不打开环, 从而保留了燃料的热值，成为近年来研究的热点[5]。其中节杆菌属是土壤中常见的一种细菌，能够在0 ℃～35 ℃之间生长，革兰氏染色阳性，有明显的杆－球状生长周期，不运动，专性好氧，呼吸代谢，不能发酵代谢[6]，属于高G+C%含量细菌[7]。该属菌株能够通过4S途径打断有机硫杂环化合物的CS键[8]。该属的营养变异性很大，曾分离到能分解菲、苯乙酸、苯胺和其他特殊化合物的菌株。此外该属某些菌株能产生高效微生物絮凝剂[9]。用于脱硫的微生物可以是静止期的细胞也可以是生长期细胞，而生长过程会影响细菌脱硫的效率[10]。 本文从油田土壤中分离出1株可以降解DBT的菌株（命名为ZYX），并对其生长特性开展了进一步的研究工作。 二苯并噻吩（DBT）噻吩类化合物，羟基联苯（HBP）购自Fluka公司；KH2PO4、NH4Cl、 Na2HPO4·12H2O、MgCl2·6H2O、甘油等均为国产分析纯。 样品来自中原油田某处受原油污染土壤。 基础培养基BSM(g·L-1)[11]：KH2PO4 2.44, Na2HPO4·12H2O 14.03, MgCl2·6H2O 0.36, NH4Cl 2.00, MnCl2·4H2O 0.004, FeCl3·6H2O 0.001, CaCl2 0.001,甘油 1.62。测得pH为7.0～7.4。 液体选择培养基BSDM：BSM中加入0.1 g·L-1 DBT为唯一硫源。 固体培养基：BSM中添加1.5%的琼脂制成。 取10 g捣碎的油田土壤样品，溶于无菌水中，振荡摇匀。静置5 min，取5 mL上清液接种于液体选择性培养基中。250 mL锥形瓶装液量为100 mL，30 ℃，170 r·m，培养5 d。之后在液体选择性培养基中每2 d转接一次，共转接3次。 用初筛得到的菌液制备一系列培养液的稀释液，分别取0.3 mL 10-3～10-5的稀释液加到固体平板上。置于恒温培养