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思考题 什么是限制性核酸内切酶，它们是怎样命名的？ II型限制性核酸内切酶的基本特性有哪些？ 什么是粘性末端、平末端？ 酶的单位是怎样定义的，影响酶活性的因素有哪些？ DNA连接酶的作用特点有哪些？ 大肠杆菌DNA聚合酶I 有哪些不同的酶活力特性，各有何利用价值。 Klenow片段和大肠杆菌DNA聚合酶I有何异同？ 基因克隆的载体必须具备哪些特性？ 质粒载体的生物学特性有哪些？ PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 第1轮结束 第2轮开始 1、DNA连接酶作用的特点 2、DNA连接酶的反应条件 第二节 DNA连接酶及其应用 DNA连接酶作用的特点 A. 连接的两条链必须分别具有 3′端自由羟基（-OH） 和5 ′端磷酸基团（-P），而且只有这两个基团彼 此相邻时才能进行连接反应； B. 在羟基和磷酸基团间形成磷酸二酯键是一种耗能过 程，因此连接反应必须有能量分子的参与，通常有 两种能量分子，即ATP和NAD+。 OK NO DNA连接反应的条件 连接反应最佳温度为37℃，但是此时粘性末端间氢键结合不够稳定，而且酶活性也会迅速降低。比如，EcoRI 粘性末端连接部位只有4个碱基对，很容易断开。所以通常在4-16℃连接。 影响连接效率的因素有： A. 温度（最主要的因素） B. ATP的浓度( 10?M - 1?M ) C. 连接酶浓度（平末端较粘性末端要求高） D. 反应时间（通常连接过夜） E. 插入片段和载体片段 的摩尔比 转化 4℃ 过夜 加反应液 CK- 重组菌落 CK+ 粘性末端DNA片段的连接 Nick Nick 1、大肠杆菌DNA聚合酶I 2、Klenow片段 第三节 DNA聚合酶及其应用 大肠杆菌DNA聚合酶I （E。Coli DNA pol I）是Kornberg A. 1956年首先从大肠杆菌E。Coli 细胞中分离出来的。它是一种多功能性的酶，包括 3种不同的酶活力： 5′- 3′聚合酶活性 以双链DNA为模板，催化单核苷酸结合到引物的3′末端，并不断延伸。 5′- 3′外切酶活性 将双链DNA中游离的5′末端逐个切去。 3′ - 5′外切酶活性 将游离的双链或单链DNA的3′端降解。不过对于双链的降解可被5′-3′的多聚活性所抑制。 CCG GGCTATCGGA CCG GGCTATCGGA Pol I + Mg2+ A T A G CCT CCGATAGCCT GGCTATCGGA CCGATAGCCT GGCTA CCGATAGCCT GGCTATCGGA Pol I + Mg2+ CCGATAGCCT GGCTA Pol I + Mg2+ T 1、大肠杆菌DNA聚合酶I 2、Klenow片段 第三节 DNA聚合酶及其应用 Klenow片段的主要用途 Klenow片段大肠杆菌聚合酶 I 全酶经枯草杆菌蛋白酶处理后产生的大片段酶分子，它仍然有5′→3′的聚合酶活性和3′→ 5 ′的核酸外切酶活性，但失去了5′→3′的外切酶活性。 Klenow片段的主要用途 修补限制性酶消化DNA形成的3′隐蔽末端 标记DNA片段的末端 cDNA克隆中第二链cDNA的合成 DNA序列的测定 GAA CTTAA 第三章 基因克隆的载体 引 言（introduction） 第一节 质粒载体（plasimid vectors） 第二节 噬菌体载体（phage vectors） 第三节 柯斯质粒载体（cosmid vectors） 第四节 人工染色体载体（B/Y/HAC） 引 言 基因克隆的本质是使目的基因在特定的条件下得到扩增和表达，而目的基因本身无法进行复制，所以就必须借助于“载体”及其“寄主细胞”来实现。 作为基因克隆的载体必须具备以下特性： 能在寄主细胞中进行独立的复制和表达； 具有1-2个选择标记基因，如对抗生素的抗性基因等； 具备多克隆位点（MCS），而且可携带外源DNA片段的长度范围较宽。 自身分子量较小，在寄主细胞中的拷贝数高，易于操作和DNA的制备。 Characteristics of vectors for gene cloning MCS Marker Foreign gene 第三章 基因克隆的载体 引 言（introduction） 第一节 质粒载体（plasimid