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人喉鳞癌细胞端粒长度与放射敏感性的关系探讨作者单位：430071 武汉大学中南医院放化疗科 【摘要】? 目的 探讨人喉鳞癌细胞端粒长度与放射敏感性的关系，以寻求能够预测肿瘤细胞内在放射敏感性的分子标志物。方法 体外长期传代的人喉鳞癌细胞系hep2经0、2、4、8、12gy剂量照射3次后的存活后代体外培养20代，以克隆形成实验测定其放射敏感性参数sf2，用southernblotting法测定其端粒长度（trf）。结果 体外长期传代的hep2细胞系随着受照剂量的增加, 其放射存活后代的sf2逐渐升高(p0.05)，其trf逐渐缩短（p0.01）；而且，sf2与trf呈现明显的正相关关系（r=0.921, p0.01）。结论 通过不同放射剂量处理体外长期传代的人喉鳞癌细胞系可获得不同放射敏感性的细胞存活后代，且放射存活后代的放射敏感性与其细胞端粒长度具有较好的负相关关系，提示端粒长度检测有望成为预测肿瘤细胞内在放射敏感性的分子标志物。 【关键词】? hep2细胞系 端粒长度 内在放射敏感性 ??? 肿瘤细胞常伴有端粒长度的缩短和端粒酶的激活[1]，而缩短的端粒易导致染色体的不稳定性增加并可能进而影响肿瘤细胞的放射敏感性[2] 。因此，本实验以在体外长期传代的人喉鳞癌细胞系作为研究对象，对肿瘤细胞内在放射敏感性与其端粒长度的关系进行研究，以探讨端粒长度检测是否可能成为预测肿瘤细胞内在放射敏感性的分子标志物，从而为肿瘤的个体化放疗提供基础性理论依据。 ??? 1? 材料与方法 ??? 1.1? 细胞培养? 人喉鳞癌细胞系hep2购于武汉大学中国典型物保藏中心，由武汉大学医学院肿瘤研究所体外传代14个月。将细胞传代后分为5组，待细胞长满100ml培养瓶底后，分别接受0、2、4、8、12gy单次剂量照射（60coγray，剂量率78.72cgy/min），照射后4小时换液，待细胞长满培养瓶底后再行上述剂量照射，如此共3次。后将5组细胞传20代获得它们的放射存活后代（分别标为a、b、c、d、e组），以用作下一步的实验对象。所有细胞均在含有10%小牛血清的rpmi1640（美国gibco）培养基中、37、5%co2条件下培养。同步收集指数生长期细胞进行下述指标的测定。 ??? 1.2? 克隆形成实验? 将细胞消化，计数，稀释，分别接种不同细胞数于50ml培养瓶中, 5%co2培养箱内37静置4～6h，细胞贴壁后分别接受0、1、2、3、4、6、8、10gy单剂量照射（60coγray，剂量率72.97cgy/min）。照射后培养14～21d，用1%甲紫无水乙醇溶液固定染色20min，计数≥50 个细胞的克隆。以每次实验的0 gy组计算克隆形成率（plating efficiency,pe），克隆形成率(pe)＝克隆数/接种细胞数×100 % 。各实验组的细胞存活分数(survival fraction，sf)＝照射后细胞形成的克隆数/（接种细胞数×未照射细胞克隆形成率）计算。每个剂量点设3个平行样本，实验重复3次，取均数。用多靶单击模型和线性二次模型拟合细胞存活曲线并计算放射敏感性参数α、β、d0 ，sf2取原始数值的均数。 ??? 1.3? 端粒长度(mean length of telomere restriction fragments,trf)的测定? 每组收集2×106个细胞，采用southernblotting法测定其端粒长度。端粒长度测定试剂盒系瑞士roche molecular biochemicals公司产品。高低分子量对照由试剂盒提供，其trf分别是10.2kb和3.9kb。细胞dna的提取采用酚抽提法。后经基因组dna的消化、电泳、转印、杂交、胶片感光。最后用bioid光度图象分析系统分析胶片，并以公式trf＝σ（odi）/σ（odi/li）计算被测样本的平均端粒长度[其中odi为位置i处的吸光度值，li为位置i处的平均分子量（相应处的端粒长度）]。实验重复3次。 ??? 1.4? 细胞群体倍增时间（population doubling time, pdt）的测定? 将细胞消化，计数，稀释，每组取2×105个细胞接种于100ml培养瓶中，分别于培养24、48、72、 96h时消化，计数。实验重复3次。并按patterson公式pdt＝t×lg2/lg(n/n0)计算细胞的群体倍增时间(t为细胞计数与细胞接种的时间间隔，n为计数时的细胞数，n0为接种细胞数)，取每组每次实验的pdt均值。 ??? 1.5? 统计方法? 本研究采用完全随机设计，利用spss11.0统计软件进行方差分析。以每组每次实验的sf2、trf、pdt均值进行直线相关分析。 ??? 2结果 ??? hep2细胞不同剂量照射存活后