人血白蛋白结合功能比较研究.docVIP

人血白蛋白结合功能和产品质量比较研究 摘要：目的 通过对人血白蛋白与小分子药物结合功能的研究，反映目前国内外生产的人血白蛋白的质量状况。方法： 采用地西泮和槲皮素与脱脂后的人血白蛋白进行结合，通过超滤分离透析液，测定游离地西泮和槲皮素含量，计算两种物质和人血白蛋白的结合率。结果：***。结论： 目前各厂家生产的人血白蛋白和小分子物质结合功能基本一致。 关键词：人血白蛋白；地西泮；槲皮素；结合功能 人血白蛋白（HSA）是人体内含量最高的蛋白质，在维持血浆渗透压和运输小分子物质等方面都有十分重要的作用。作为小分子药物的载体，白蛋白能与药物可逆性结合，从而影响药物的分布和代谢[1]。 HSA的分子量为66248，其一级结构是由585个氨基酸残基组成的一条多肽链。HSA的二级结构包括I、II、III三个a-螺旋的结构域(domain)，其中每个结构域又分为A和B两个亚结构域(subdomain)。现在认为多数药物的结合位点主要集中于两大位点，位点I(华法令结合位点)和位点II(地西泮／吲哚结合位点)，分别位于亚结构域IIA和IIIA上。 目前，临床上使用的HSA的生产工艺主要有低温乙醇法和层析法，但国内生产的人血白蛋白都是由低温乙醇法制备。目前，HSA的质控指标包括纯度、分子大小分布等，但并未包括反映HSA功能或活性的指标包括渗透压和结合功能。而通过对HSA与小分子药物的特异性结合功能的研究，可以反映HSA分子结构的完整性，从而反映工艺过程对分子结构的影响程度，对于HSA质量控制等具有一定的指导意义。 我们选取了槲皮素和地西泮作为HSA结合功能研究的标志药物。槲皮素和地西泮的主要结合位点分别位于位点I和位点II，与白蛋白结合常数分别为1.16×106L/mol和4.7×105L/mol。我们分别对目前国内外几家血液制品企业生产的产品进行比较研究，以了解不同厂家和生产工艺对HSA质量的影响。 材料和方法： 1. 主要仪器 可见-紫外分光光度计，酸度计，超滤系统，恒温箱，高效液相色谱； 2. 主要试剂 地西泮（购自中国药品生物制品检定所标准品），槲皮素（购自Sigma公司），HSA（分别来自***），Sephadex G-25脱盐柱（购自GE公司）。 3. 样品预处理 按照2gHSA/g活性炭的比例，将活性炭加入人血白蛋白中混合，用HC1调pH至3.0，冰浴搅拌1 h，2℃，15,000 r/min离心20min除去活性炭，然后用0.22um滤膜过滤，再用NaOH调pH至7.0，脱脂后样品进行全波长扫描。 4. HSA与地西泮的结合实验 用10%甲醇溶液配制0.1mmol/L地西泮溶液。在366nm处测定不同浓度的地西泮溶液并作标准曲线。取15ml地西泮溶液中加入定量HSA，在37℃下平衡透析10min，取透析液在366nm处测定游离地西泮含量。另取蛋白液样品分别测定地西泮总含量和蛋白含量。 5. HSA与槲皮素的结合实验 用95％乙醇配制1×10-3mol/L槲皮素储备溶液，将此溶液用水稀释成2×10-5mol/L溶液备用。测定不同浓度的槲皮素溶液在360nm的吸光度并作标准曲线。取15ml槲皮素溶液加入定量HSA，在37℃平衡透析10min，取透析液在360nm处测定游离槲皮素含量。另取蛋白液样品分别测定槲皮素总含量和蛋白含量。 结果： 1. 地西泮在366nm处的含量-吸光度标准曲线 2. 地西泮与不同厂家HSA的蛋白结合率 样品名称 游离地西泮含量 地西泮总含量 蛋白质含量 蛋白结合率 （mol/mol） 3. 槲皮素在360nm处的含量-吸光度标准曲线 样品名称 游离槲皮素含量 槲皮素总含量 蛋白质含量 蛋白结合率（mol/mol） 4. 槲皮素与不同厂家HSA的蛋白结合率 讨论： 1. 对国内外各企业生产的人血白蛋白结合功能的测定结果不存在显著差异，国内人血白蛋白产品的活性指标总体上不低于国外产品。说明目前人血白蛋白生产工艺比较成熟稳定，另外，人血白蛋白本身质量比较稳定可能也是其中的原因之一。 2. 人血白蛋白结合功能的研究方法包括平衡透析、超滤、超离心和光谱等方法。本文采用的超滤透析方法基于药物结合的平衡原理，受实验条件的干扰较小，结果稳定可靠，属于药物-蛋白结合的经典参比方法[1]，而且由于使用了超滤系统，游离药物可以直接从透析液中提取，从而解决了平衡透析存在的实验过程过长的问题。 3. 本法可能存在的一些缺点，如使用超滤系统可能造成样品交叉污染，在进行本实验时，超滤系统均使用20倍体积的缓冲溶液冲洗，并检测透析液吸光度低于0.001。另外，超滤膜本身对于药物分子可能存在一定的吸附作用，但可以通过未加入白蛋白的药物溶液同时做平行实验来进行校正。 参考文献： 1. 郭宾, 李川. 药物与血浆蛋白结