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十二、猪细小病毒检测方法 猪细小病毒血凝抑制试验操作方法 （一）材料准备 1．抗原：猪细小病毒浓缩抗原 2．PPV阳性及阴性血清 3．被检血清：自被检猪的前腔静脉血或自耳静脉采血分离血清。 4．红细胞：按抗凝剂与血液1：4的比例心脏采集豚鼠血液，用PBS洗三次，沉积红细胞配成0.5%悬液备。 5．稀释液：用灭菌的PH7.2磷酸盐缓冲液（PBS）。 6．25%白陶土：取白陶土25克mol/L盐酸溶液，充分搅匀，2 000转/分钟离心10分钟，弃上清，再加1mol/L盐酸溶液，搅匀，离心，反复洗三次，沉淀白陶土，用0.15mol/L生理盐水100毫升mol/L氢氧化钠溶液调pH7.2左右,高压灭菌,置4℃备用,保存期不超过半年。 7．器材：96孔U型滴定板或V型滴定板，25微升微升微升微升微升微升微升微升”。 1．定性试验：取检测样品（血清）、阳性血清、阴性血清、稀释液各一滴，分置于玻片上，各加乳胶抗原一滴，用牙签混匀，搅拌并摇动1~2分钟，于3~5分钟内观察结果。 2．定量试验：先将血清作连续稀释，各取1滴依次滴加于乳胶凝集反应板上，另设对照同上，随后再各加乳胶抗原一滴，如上搅拌并摇动，判定。 （三）结果判定 1．判定标准： “++++”全部乳胶凝集，颗粒聚于液滴边缘，液体完全透明； “+++”大部分乳胶凝集，颗粒明显，液体稍混浊； “++”约50％乳胶凝集，但颗粒较细，液体较混浊； “+”有少许凝集，液体呈混浊： “—”液滴呈原有的均匀乳状。 2．对照试验出现如下结果试验方可成立，否则应重试：阳性血清加抗原呈“++++”；阴性血清加抗原呈“—” ；抗原加稀释液呈“—”。 以出现“++”以上凝集者判为阳性凝集。 （四）注意事项 1．试剂在2~8℃冷暗处保存，暂定1年。 2．乳胶抗原在使用前应轻轻摇匀。 (吴 斌) 聚合酶链式反应（PCR）检测猪细小病毒 1 材料准备:待检组织、组织匀浆器、蛋白酶K，十二烷基磺酸钠（SDS），苯酚、氯仿，异戊醇（分析纯）、TEN缓冲液。 引物：扩增猪细小病毒VP2基因中445bp基因片段，由上海生物工程公司合成。 序列为, 上游引物P1: 5’-CAGAATCAGCAACCTCAC-3’ 下游引物P2: 5’-TGGTCTCCTTCTGTGGTAGG-3’ 仪器设备有：凝胶电泳紫外线检测仪， PCR扩增仪，电泳仪 2操作步骤： 2.1 样品的采集：采集病猪的淋巴结、肝脏置-20℃保存。 2.2 样品处理 所采病料经组织研磨器充分研磨，按1:5用TEN缓冲液悬浮收集于离心管内，-70℃反复冻融3次，7000r/min离心5min。取上清液472.5μl,加入25μl 10％SDS和2.5μl的20mg/ml 蛋白酶K，50℃水浴摇床上放置2h后加入等量的饱和酚500μl，涡旋20s。离心取上清液，加等量的酚：氯仿：异戍醇（25:24:1）抽提一次，再用氯仿：异戍醇（24：1）抽提一次，最后用乙醇沉淀，真空抽干后加入20μl双蒸水溶解，-20℃贮存备用。 2.3. PCR的操作程序 PCR反应体系为：总体积50μl，含有100μmol/L dNTPs，5μmol/L引物， 0.5U Taq酶及1μl模板DNA，常用的反应体系组成如下： 10×缓冲液 5.0 μl 25mM MgCl2 5.0 μl dNTPs 1.0 μl 引物 各1.0μl Taq聚合酶 0.5μl DNA模板 1.0μl 灭菌去离子水 35.50μl 扩増条件为:94℃变性3分钟，进入循环，94℃45秒，54℃45秒，72℃30秒，30个循环后，72℃延伸10分钟。 2.4 PCR产物的检测 PCR扩增产物在0.8％的琼脂糖凝胶上电泳，溴化乙锭染色，在紫外光下观察结果，并与标准分子量比较，可见一条445bp的DNA片段。 （华中农大吕建强）