多效型杆状病毒表现载体的开发与应用.docVIP

多效型桿狀病毒表現載體的開發與應用 吳 宗 遠 中原大學 生物科技學系 在過去的20年間桿狀病毒表現系統是最廣為使用的真核表現系統之ㄧ。自從Smith等人於1983年成功的以加州苜蓿夜蛾核多角體病毒（Autographa californica multiple nucleopolyhedro virus, AcMNPV）作為表現載體（Smith, et al., 1983），在昆蟲細胞中表現具生物活性的β-干擾素（β-interferon）起，已有上千種以上的蛋白質，成功的以桿狀病毒表現系統進行生產（Kost, et al., 2005）。可以生產大量的外源蛋白是桿狀病毒表現系統廣為使用的原因之一，每個受狀病毒感染的昆蟲細胞，於感染後的3~5天細胞內約可累積30~50％桿狀病毒之包涵體蛋白（polyhedrin protein）或分子量為10kDa的纖維蛋白P10（P10 protein），而此兩高表現之基因於細胞培養之條件下，對於病毒之增殖並非必需的基因（non-essential gene），是故欲生產之外源蛋白，通常將其基因先選殖進桿狀病毒的轉移載體（transfer vector），再利用同重組（homologous recombination）的方式，將其基因置換polyhedrin gene或p10 gene，而以強效啟動子polyhedrin promoter或p10 promoter進行外源基因的表達（O’Relly, et al., 1992；Possee, 1997）。當以細胞培養方式進行生產時，通常可達每公升1~500 mg的重組蛋白產量。 除了產量高以外，桿狀病毒相較於細菌或酵母菌等表現系統還有下述之優點：（1）其後轉譯修飾作用（post-translational modification），如磷酸化（phosphorylation），醣基化（glycosylation）或是fatty acylation等都較細菌或酵母菌表現系統更接近高等真核生物（2）可提供較佳之蛋白質摺疊環境，而不會產生inclusion body（3）桿狀病毒為環狀DNA病毒可以攜帶較大之DNA片段（4）於桿狀病毒感染的昆蟲細胞仍能執行intron剪接之功能，因此對於由哺乳動物genomic DNA library選殖出的基因仍可進行生產（5）相對於哺乳動物細胞，昆蟲細胞較易培養，如不需要CO2及對度變化有較大之耐受性（6）操作簡易快速，不若基因轉殖動物或需要較長之時間重組蛋白的生產；例如1997年，當香港發生H5N1禽流感而造成人類死亡時，Protein Sciences, Inc.在與美國NIH的合作下，僅八週的時間，即利用桿狀病毒收產出第一批H5N1疫苗。於後基因時代 (postgenomic rea)，蛋白表現系統，基因療法疫苗的生產，多基因表現載體 (polycistronic vectors)的研發是一極重要的課題。當以yeast two-hybrid 對酵母菌之蛋白質交互作用網路進行大規摸的分析顯示，於酵母菌 (baker′s yeast) 中，每一蛋白質可與平均5~8其之蛋白質有交互作用，顯示於真核系統中，執行細胞之機制，諸如轉錄、轉譯作用，胞器運輸，能量生產與生物轉換 (biotransformation)等過程的multiprotein complexes 通常由6~9個不同的蛋白質次單元 (subnit) 所組成，而欲生產完整的multiprotein complexes 時，若由單一蛋白個別生產，不但會有組裝(assembly)的障礙，單一表現的次單元通常溶解度(solubility) 與活性 (activity) 會比較低，Selleck等人最近完成能讓大腸桿菌進行四個transcription fators)之次單元的多基因載體構築。另一方面，為了應付更多對人類深具威脅的病毒，建立在VLP (virus-like particles) 基礎上疫苗研究發展也日益受到重視，而快速生產VLP，能夠ㄧ次產生四個以上的病毒蛋白 (virus proteins, VP)即是一大關鍵。，在基因療法上，經過多年的嚐試，亦發現要能有效地達到治療的效果，同時給予多個基因是必要的。最明顯的例子是以介白素12 (interleukin 12, IL-12) 進行癌症的基因療法時，同時有效地表現IL-12的兩個次單元 (p35和p40) 是必要的，而若要同時表現IL-12干擾素-γ (interferon-γ)，則發展多基因表現載體便無可避免。 然則以基因融合的方法進行蛋白生長時，除了有 inframe-linker的不確定性外還可能會遇到蛋白質摺疊的過程中，兩個蛋白質互相干擾的情形，而不利生產。以雙啟動子的模式，