干旱对小麦的测定.docVIP

小麦抗旱性测定—渗透胁迫与脯氨酸积累 一、实验目的 了解植物体内水分亏缺与脯氨酸积累的关系 。水分亏缺是一中最普遍的影响作物生产的环境胁迫，了解作物的抗旱性，进行抗旱育种。 二、实验原理 脯氨酸是水溶性最大的氨基酸，具有很强的水合能力，其水溶液具有很高的水势。脯氨酸的疏水端可和蛋白质结合， 亲水端可与水分子结合， 蛋白质可借助脯氨酸束缚更多的水， 从而防止渗透胁迫条件下蛋白质的脱水变性。因此，脯氨酸在植物的渗透调节中起重要作用，而且即使在含水量很低的细胞内， 脯氨酸溶液仍能提供足够的自由水，以维持正常的生命活动。正常情况下，植物体内脯氨酸含量并不高，但遭受水分、盐分等胁迫时体内的脯氨酸含量往往增加，它在一定程度上反映植物受环境水分和盐度胁迫的情况，以及植物对水分和盐分胁迫的忍耐及抵抗能力。 植物体内脯氨酸的含量可用酸性茚三酮法测定。在酸性条件下，脯氨酸和茚三酮反应生成稳定的红色产物，该产物在520nm有一最大吸收峰，其色度与含量正相关，可用分光光度法测定。该反应具有较强的专一性，酸性和中性氨基酸不能与酸性茚三酮试剂形成有色产物， 碱性氨基酸对这一反应有干扰， 但加入人造沸石，在pH1~7范围内振荡溶液可除去这些干扰的氨基酸（如甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸，精氨酸等2-氨基的氨基酸）。 三、器材与试剂 实验仪器 可见光分光光度计，低速离心机，水浴锅，研钵，烧杯，移液管，容量瓶，具塞试管，冰醋酸。 ??实验试剂 冰醋酸，甲苯，3% 磺基水杨酸，0.3 mol/L 甘露醇（54.65g甘露醇溶于1000 ml蒸馏水中），10μg/ml标准脯氨酸溶液（1mg脯氨酸溶于100 ml 80%乙醇中，浓度为10μg/ml），酸性茚三酮试剂[2.5 g茚三酮置于60 ml冰醋酸和40 ml 6 mol/L磷酸中（见附录表1），加热（70℃）溶解。试剂24 h内稳定]。 ??实验材料 小麦麦苗 四、实验步骤（一）标准曲线的绘制 （1）在分析天平上精确称取25mg脯氨酸，倒入小烧杯内，用少量蒸馏水溶解，然后倒入250ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，此标准液中每ml含脯氨酸100μg。 （2）系列脯氨酸浓度的配制取6个50ml容量瓶，分别盛入脯氨酸原液1.0，2.0，3.0 ， 4.0 ， 5.0及6.0ml，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，各瓶的脯氨酸浓度分别为2，4，6，8，10μg/ml （3）取5支试管，分别吸取2ml系列标准浓度的脯氨酸溶液，加入2ml蒸馏水，2ml 3%磺基水杨酸、2ml冰醋酸和4ml酸性茚三酮溶液，每管在沸水浴中显色1h。 （4）冷却后各试管准确加入4ml甲苯，振荡30S，静置分层，使色素全部转至甲苯溶液。 （5）用注射器轻轻吸取各管上层脯氨酸甲苯（红色甲苯相）溶液至比色杯中，以甲苯溶液为空白对照，于520nm波长处进行比色。 （6）标准曲线的绘制：先求出吸光度值（Y）依脯氨酸浓度（X）而变的回归方程式，再按回归方程式绘制标准曲线。 （二）含量测定 .取地上部材料0.5g剪碎后，加5ml 3%磺基水杨酸研磨，匀浆移至离心管，在沸水中提取10min，冷却至室温后，3000r/min离心10分钟，取上清液2ml，分别加蒸馏水2ml、冰醋酸2ml和2.5%茚三酮4ml，置于沸水浴显色1h。冷却后于520nm处比色。从标准曲线上查出脯氨酸含量。结果分析 当植物遭到渗透胁迫，造成生理性缺水，植物体内脯氨酸大量积累，植物脯氨酸含量作为植物缺水的试验指标。 实验小结 1.选取实验材料时，应选生长较好的叶片，不可选用已枯死的叶片。且应避免选取发黄、发红的叶片，以免影响实验结果。 2. 茚三酮虽无色，但与蛋白质会发生显色反应，故使用时应小心避免与皮肤接触。 3. 制作标准曲线时，应用2ml蒸馏水+ 2ml 3%磺基水杨酸+2ml冰醋酸+4ml茚三酮比色。 4、在环境胁迫条件下，植物体的脯氨酸含量明显变化。