总RNA的提取测定及逆转录.docVIP

总RNA的提取及测定（Trizol法） (1)组织匀浆 ①取出高温高压消毒后研钵，切取50-100mg冰冻组织置于研钵内，倒入液氮，研至粉末状。 ②每50-I00mg匀浆组织标本加入lml的Trizol继续研磨。（标本的量不能超过Trizol体积的10%，否则会出现DNA污染。） ③将以上匀浆标本转移到1.5ml的EP管中，在15-30℃放置5分钟，以彻底分离核蛋白复合体。（或-70°C过夜后再进行） (2)相分离 加入0.2ml的氯仿，加盖好后用手剧烈摇荡巧秒，在15-30℃放置2-3分钟，然后4℃离心12000g，15分钟。离心后分成3层，下面的红色为酚-氯仿相，一个中间层（DNA和蛋白质），上层是无色的水相。RNA只存在于水相中。水相占总Trizol的60%。 (3)RNA沉淀 将上层水相转移到另一干净的1.5mlEP管中，加入0.5ml异丙醇，轻柔上下颠倒混匀，15℃-30℃静置10分钟，然后4℃，12000g离心10分钟。在管的侧壁和底部可看到絮状胶样沉淀，这就是RNA沉淀。 (4)RNA洗涤 弃上清，加入1ml 75%乙醇洗涤RNA沉淀，轻弹管壁使RNA沉淀漂浮，4℃，7500g离心5分钟。 (5)RNA再溶解 去上清，置真空或空气中5-10分钟，干燥RNA沉淀，(不能在真空中离心干燥。注意不能将RNA沉淀完全干燥，这样会极大地降低它的溶解度。)根据RNA的量，用DEPC水（20-60μl）重悬RNA沉淀，用枪头反复吹打几次，静置10分钟。 (6)测定RNA浓度: 2μl DEPC水2次调零。2μl样品测其RNA浓度。A260/A280的值在 1.8-2.0范围视为纯度很高。（RNA于-70°C保存） 逆转录(RT) 取2μg总RNA加入lμl随机引物，用DEPC水补充体积为15μl。 70°C反应5分钟，置于冰上。 加入以下反应体系： 5xM-MLV逆转录缓冲液 5ul M-MLV(200U/ ul) 1ul 4xdNTP(10mol/L) l.25ul RNasin(40U/ ul) 0.6ul DEPC水 2.25ul 总反应体积25ul 置于PCR扩增仪中25℃10分钟，37℃60分钟，95℃5分钟终止反应。逆转 录产物加80ul灭菌ddH20混匀并分装，于-20℃保存。 PCR及琼脂糖凝胶电泳 PCR反应体系： TakaRaExTaqDNA聚合酶 0.25 ul 0.25 ul 10XReaetion Buffer 5 ul 5 ul 4XdNTP 4 ul 4 ul Primer1 1 ul 0.6 ul Primer2 1 ul 0.6 ul 待测 cDNA 1 ul 1 ul 灭菌ddH2O 37.75 ul 38.85 ul 总体积 50 ul 50 ul 2%琼脂糖凝胶电泳鉴定产物是否为特异目的片段： 称取琼脂糖0.6g放入200ml三角烧瓶中，加入30ml 1xTBE溶液，加热令其完全溶解，待冷却至约60℃时加入2ul溴化乙锭溶液(10mg/ml)，浇板，水平放置，避光待凝。 将已制备的2%琼脂糖凝胶放入电泳槽，加入 1xTBE至高出凝胶表面1mm。 10 u1 PCR产物分别和2 ul 6x加样缓冲液混匀后上样电泳，另取6ul DNA LadderMaker作为DNA片段大小的对照。80V-120V电压下电泳20-30分钟。 所需试剂 RNA提取试剂TRIZOL：Invitrogen公司 焦碳酸二乙酯（DEPC）：Sigma公司（进口分装） 氯仿 异丙醇 75%乙醇:无水乙醇加DEPC水配制 核糖核酸酶抑制剂（RNAsin）：华美生物工程公司 随机引物：上海生工生物工程公司 dNTP：北京天为时代公司 M-MLV逆转录酶：Promega公司 M-MLV逆转录缓冲液 DEPC水 TakaRaExTaq DNA聚合酶：宝生物工程有限公司 目的基因引物：上海生工生物工程公司 10*React