通用探针实时荧光PCR检测禽病毒病方法地研究.pdfVIP

中国畜牧兽医学会动物传疑腐学分会第十二次学术研讨会 为3，10·将3份阳性样本进行测序。结果表明，它们与A【Ⅳg唱基因核苷酸序列同源性为 97．8～98．9％，说明本方法检测I临床样本准确性高． 3讨论 禽白血病给我国养禽业造成的经济损失巨大，但本病目前并无有效的治疗方法，也无有 效的药物及疫苗。挣化鸡群。及时淘汰处理病鸡和可疑鸡是控制本病的主要措施。快速、特 异和高遥量的检测方法为该措旌的实施提供了有力工具．奉研究首次建立了检．铡禽自血病的 荧光定量PCR方法，能特异性扩增ALv的gag基因．可以检测到的最低拷贝数是82个，比 RT-PcR方法灵敏度高出1矿倍．该方法的组内差异为o．289“1．45％；组间差异为2．13％．3．84％， 证明了此方法有很好的可重复性和稳定性． 鸡群的134份粪便棉拭纸进行ALⅣ检测，检出率为38．1％。结果表明本实验方法在实际临 床应用中也具有很高的敏感性．对临床样本检测的结果表明了禽白血病的广泛存在．并且在 鸡群中感染率相当高。因此建立检测禽自血病病毒的荧光定量PcR方法为禽白血病的快速 诊断、大规模检疫、流行病学调查以及药物筛选等提供了新的检测方法。 参考文献略 通用探针实时荧光PCR检测禽病毒病方法的研究 田振宇“．是时友’，郜彤彤‘，尹燕博‘．牛钟相‘ (1．山东溴兰生物工程研究院青岛山东2黼lol2．山东农生大学泰安山东27IOl8) 蔷蔓通用探钎是赛时荧光PcR撂竹类的一种，兵有高度．寺特异桂和灵敏度，可对样品进行准确的定量 分析．本试验主要时通用探针检测青病毒痛迭一方法进行了研究．试验结果王示奉方法的特异性．灵敏度 和伽M蚰探竹相近，且具有操作简便．费用低康等优点． 关键词实时荧光PCR通用探针 通用模扳 荧光实时定量PcR由美国应用生物系统公司(APpljcdBios)，stems)1996年发明，其化学 原理包括探针类和非探针类两种…．探针类是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产 物的增加，由于增加了探针的识别步骤，特异性更高”1．非探针类则是利用荧光染料或者 特殊设计的引物来指示扩增的增加，非探针类由于不用探针。特异性受到质疑口】，例如荧 光染料可与所有的双螺旋DNA结合发出荧光，不可区分特异性扩增和非特异性扩增，极易 造成假阳性． 常用的探针类对不同病毒则需要合成特异性的探针，这样大大增加了费用同时也使操作 繁琐化。通用探针是指在普通引物5’端连接一段约20bp的寡聚核苷酸，这一寡聚核苷酸称 为通用模板，和通用模扳互补的另一寡聚核苷酸称为通用探针，通用探针的5．端标记荧光 报告基团，3’端标记荧光淬灭基团…．在PCR扩增过程中．利用T面聚合酶的5’—◆3， 外切活性．将荧光报告基团和淬灭基团切割下来，从而释放出荧光。根据荧光值的变化可定 量检测样品中病毒的含量“1．通用探针在检测不同病毒时可使用同一探针，无需合成针对 不同病毒的特异性探针，如此降低了费用．简化了操作．本文主要以新城疫病毒(№wc∞tle Di∞a∞vim∞，NDv)为例对这一研究方法进行探讨． 1材科和方法 1．1毒株 鸡新城疫病毒(N明哟stleDise弘e 兽药监察所；传染性喉气管炎病毒(IIl劬io懈【丑ryllgot伯chenisvimse，ILT)，传染性支气 Bt{onchi石s 管病毒((IlIf色ctious Disea靶 Vi憾，IBv)、传染性法氏囊病病毒(In觚io∞bursal 317 禽类传染病 V矗u辩，mDv)由本实验室保存．鸡新城疫病毒F蛋白基因阳性质粒自制． 1．2仪器和试剂 1．2．1仪器 超净工作台(苏净集团安泰公司)，Myge眦25’cR扩增仪(杭州郎基科学仪器有限公 司)、紫外分光光度计C上海凌光技术有限公司)、FQD33A实时荧光PCR仪(杭州博日科技 有限公司)、TGLl6G台式离心机(上海安亭科学仪器厂)，TLLC台式高速冷冻离心机 (北京四环科学仪器厂)． 1．2．2试荆 M．MLv Trjs酚裂解液(自配)i 1铀DNA聚合酶、dNTP、M