干海参线粒体的提取和纯化研究.pdfVIP

干海参线粒体的提取与纯化研究 单懿薛长湖李兆杰 (中国海洋大学食工系) 摘要 以干海参为原料，采用优化后的溴化十六烷基三甲基铵(CTAB)法提取其线粒体，通过 A2一cIA280值、琼脂糖凝胶电泳和PCR检测，对所得线粒体溶液进行定量，定性分析和综合比较， 为干海参的分子生物学研究提供了～套迅速、经济和可靠的技术方案。 关键词干海参线粒体提取PCR 药材。在《本草纲目》、《中国药用动物志》等药学著作上均有记载。l临床用于肾虚阳萎、便秘、 贫缸、胃溃疡、糖尿病、肿瘤等疾病的防治【11。近年来，海参的开发研究日益受到重视。从组织 细胞中成功地提取DNA，是进行一切有关分子遗传学和分子生物学研究的前提。虽然文献中已 报道了许多动植物DNA提取的方法。但是研究中我们仍需要根据材料的不同情况进行DNA提取 方法的改进及筛选比较。最近，我们在对干海参进行分子标记的研究时发现，由于干海参已被加 丁处理过，且富含多肽、海参酸性粘多糖、海参甙、硫酸软骨素、胶原蛋白等多种物质。使得 DNA埋在这种黏稠胶状物中难以溶解，此DNA不能应用于分子生物学的研究。通过反复试验， 我们探索出一种迅速、简便、经济的分离纯化干海参线粒体的方法，应用该法可有效去除干海参 reaction)扩增， 中的各种杂质，得到高纯度、高得率的总DNA，可进行PCR(polymoraseChin 为于海参的进一步研究点定技术基础。 材科与方法 1．捌料 品，以少煮多泡的原则浸发开，立即使用或置于一80C超低温冰箱保存备用 2 线粒体提取纯化方法 3．1称取0,3克海参体壁，冲洗干净，用无菌纸吸千，切碎或置液氮研碎。 PH EDTAPH8．O；0．4 3．2将样品放于600ul的蛋白酶水解液(50mMTris--HCl7．5；50raM ％SDS；2％巯基乙醇12ul；20mg／ml蛋白酶K6u1)中…。 3．3样品迅速置于65。C水溶2小时以上，若溶解不完全，则可过夜处理，直至样品完全溶解。 3．4冷却至室温后，加入等体积的氯仿一异戊酵(24：1)轻柔颠倒。 3．5室温t0000转／分，离心lO分钟，收集上清液。 3．6重复以上两个步骤几次。至有机相和水相之间无变性蛋白质。 NaCl，2％CTAB)，保温于65*(2，30分钟。 3．7取上清液加入等体积的沉淀缓冲液(IM 3．8以氯仿一异戊醇抽提几次．至有机相和水相之间无杂质。 3．9收集上清液，加等体积的异丙醇轻柔颠倒，13000转／分离心20分钟。可得到白色沉淀。 3．10沉淀用70％的乙醇清洗两次，空气干燥后，用100ulTE缓冲液溶解，4C保存备用。 3 DNA纯度和浓度的测定 的大致纯度。该分析仪可读出蛋白质的浓度。在O．7％的琼脂糖凝胶中，于5V／cm电压下电泳两 小时，检测总DNA的分子质量，样品的浓度。 4 线粒体16SrRNA基因片断的扩增反应 以所提取的线粒体为模板，所用引物16SAR 3’；16SBR dNTP，0．2umol／L的每种引物，IUDNA聚合酶(上海生工)，1 2．0mmol／LMgCl2’0．2mmol／L Taq min，72℃1min，最 94℃预变性5min后经过35个循环，每个循环包括：94℃50sec，46℃l 后72℃延伸10 相记录。 结果与分析 带清晰，这表明所提取的线粒体DNA大小和纯度适合在PCR等实验中做模板，实验显示，蛋白 质基本被去除干净。 M 0 1 2 800k 700b 600bp