一种糖苷酶活性检测方法的探究.pdfVIP

一种糖苷酶活性检测方法的研究 张敏 【摘要】目的考察不同因素对糖苷酶活性的影响，建立该酶的检测方法．方法 采用黄芩苷类物质做 底物，通过紫外分光光度法在450nm处测定被酶分解产生的苷元黄芩素的含量来分析该糖苷酶活力．考 察糖苷酶在不同的pH值、温度、离子强度、底物浓度的条件下的酶活力，同时进行方法学考察，测定 该法的重现性，回收率等．结果糖苷酶的最佳水解温度是45℃，最适pH为5．8，当钠离子达到Imol／L， 苷的K．值为22．37 具有推广使用前景。 【关键词】糖苷酶；检测；活性；分光光度法 糖苷酶是维持生物体基本功能的重要酶类之一，在自然界广有分布，作为一种催化合成新型糖苷类 化合物的工具酶，一些糖苷酶具有催化效率高、稳定性强、耐特殊条件、工业适应性强、价格适宜等特 性，可以降低成本，提高产率，改进产品质量…。 糖苷酶的检测方法主要有(一)同位素标记法：用同位素[朝、[1lC]等标记底物，在糖苷酶的作用 下，根据产物的放射性强度的变化，来确定糖苷酶的活性。此方法主要用在糖苷酶和糖蛋白链的研究上， 常规检测用的较少。(二)荧光法：4—MU+糖基一4一MU+糖，不同的糖苷酶要用相应甲基伞形酮4—姗糖苷 作为底物。激发波长360nm，发射波长440nmN定幢1。(三)比色法：以生成有色化合物的显色反应为基 础，通过比较或测量有色物质溶液颜色深度来确定待测组分含量的方法，此后就逐渐为分光光度法所代 替。(四)酶联免疫分析法：制备多克隆抗体，测定有活性和无活性的酶蛋白¨1，鉴于紫外分光光度法的 优点，本实验就采用了较为常用的紫外分光光度法来检测该糖苷酶的活性，采用黄芩苷为底物，对这种 糖苷酶的检测方法进行研究。 l材料和方法 ’ 1．1材料 糖苷酶供试品，自制：黄芩苷标准品，黄芩素标准品(自制)，甲醇(分析纯)，天津广成化学试剂 有限公司。 UV-2102 冷冻干燥机，北京博医康试验仪器有限公司；SC303—4型电热恒温培养箱，浙江嘉兴新滕电器厂。 1．2方法 lamol产物黄芩 1．2．1酶活力单位IU定义测定条件下(pH值为5．8，45℃)每小时催化水解黄芩苷生成1 素所需的酶量为1个酶活力单位(IU)。 1．2．2糖苷酶活性测定方法在空白和试验管中各加入O．2mL黄芩苷溶液(2．5g／100mL)，在45℃ 下水浴，再在试验管中加入酶液2mL，混匀，同时空白管中加入2mL蒸馏水，45℃下精确反应一定时 mL甲醇溶 间后，取出冷却至室温，后8000r／min离心20min，倒出上清夜，保留沉淀，试验管沉淀用3 nm处测定其吸光度。 解，空白管弃上清夜后加入3mL甲醇做为对照，采用分光光度法在450 1．2．3黄芩素标准曲线制作配置2mg／mL的黄芩素溶液(溶剂为甲醇)，然后用甲醇(分析纯)依次 稀释至1．5 mg／mL，0．125mg／mL，再以甲醇为空白，在450rlm处测 mg／mL，1mg／mL，0．5mg／mL，0．25 定各个浓度黄芩素溶液的吸光度，黄芩素溶液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，做出标准曲线。 8．77 1．2．4最适pH值在温度为45℃、时间为24h时，分别测定了pH4．0、pH5．O、pH5．8、pH7、pH 407 和pH10．08时的酶活力。 5．8， 1．2．5最适温度分别测定在pH 80℃时酶的活力。 mol／L)的氯化钠溶液，在pH 1．2．6离子强度对酶活力影响在酶反应液中分别加入不同浓度(04 6．0，反应温度45℃时，测定