猪IFN-γ基因的克隆和在大肠杆菌的高效表达和复性研究.pdfVIP

第六次全国会员代表大会暨第11次学术研讨会 猪IFN—Y基因的克隆与在大肠杆菌的高效表达与复性研究 贾世玉1陈如明1陈国柱 马凤龙1李朝阳2乔彦良1傅兴伦1赵怀龙1 (I济南军区疾病预防控制中心，济南，250014；2山东信得药业有限责任公司，青岛，266061) 摘要根据Gene 根据大肠杆菌密码子的偏嗜性改造后克隆入原核表达载体pBV220中，鉴定后筛选表达重组菌进行发酵培 养、温度诱导后，收集菌体超声波破碎后提取包涵体并进行初步纯化，利用胱氨酸一二仁胱氨酸再氧化法对 纯化后的包涵体变性液进行分段稀释法复性研究。以细胞病变抑制法(MDBK-VSV为基本检测系统)测 定复性液的抗病毒比活性高达5．8×106U／mg。 关键词：猪IFN-7基因表达包涵体复性 1材料与方法 1．1材料 菌种：大肠杆菌JMl09和宿主表达菌DH5a由本实验室保存。 载体：pBV220表达载体，由本实验室保存。pMDl8．T LS RNA 试剂：TRIzol Reagent、RNasin、高保真pfu PCR (均为TaKaRa产品)等分别购自相关生物公司。 1．2方法 1．2．1猪外周血白细胞的分离及诱导培养111 37℃培养。 RNA的总RNA的提取 1．2．2含polFN-y 外周血白细胞总RNA，作为RT-PCR的模板。 1．2．3 RT—PCR引物设计与合成 cDNA序列【2】设计引物，为方便后续克隆，分别在各上、下游 根据genebank数据库中已有的polFN．q 引物的5’和3’末端加入相应的酶切位点。 上游引物P15’TCAGGGATCCACTCTCTCCGAAACAAT-3’ 5’GA—JTCATGCAGGCACCGTrrIvll’AAAG．3’ 上游引物P2 下游引物P35’GCGGGTCGACll淤rlv丌GATGCTCTCTGGC．3’ 1．2．4 polFN-T基因片段的扩增 1．2．4．1第一链cDNA合成 10min，冰浴5rain。加5xRT ‘ (40UIpL)0．51aL，混匀后置42℃水浴60min--70min。 1．2．4．2PCR扩增 PCRbuffer 在一新的0．5mL的薄壁反应管中依次加入下列组分：ddH2058此，lOx 10I，tL，25mmol／L dNTP 10此，2．5mmol／L MgCl2 5ll 猪·传染病 DNA聚合酶3U～4U，然后开始循环反应：95℃ 上进行扩增，条件为98C预变性5min，在80℃时加入pfu 1．2．5 PCR产物的回收与序列测定 将相应PCR产物在1％琼脂糖凝胶上电泳，切出目的条带，按PCR Kit使用说明对PCR产物 Recovery DNA Star软件进行基因序列分析。 1．2．6 poIFN-q重组表达质粒的构建po DNA连接酶连 和447bp的polFN-y全基因序列和成熟肽序列特异片段，与同样处理的pBV220载体刚T4 接，构建polFN-y重组表达质粒，转化JMl09，小量快速抽提质粒进行PCR和酶切鉴定。 1．2．7表达载体的诱导表达 扫描仪，对上述SDS．PAGE电泳蛋白带进