水生动物新型病原微生物——螺原体的发现与研究.pdfVIP

32 2007年中国微生物学会学术年会 水生动物新型病原微生物—— 螺原体的发现和研究 王 文 (南京师范大学生命科学学院 江苏省生物资源与技术重点实验室) 虾蟹是我国重要的经济水生甲壳动物，也是出口创汇的重要水产养殖品种。中华 绒螯蟹Efiocheir sinensis，俗称河蟹，是我国重要的经济水生甲壳类动物，不仅是我国沿 海、沿江、湖泊等地规模化养殖的主要对象，而且也是沿海滩涂开发特种水产养殖的水 生动物之一，具较高经济价值，自80年代以来河蟹养殖业发展迅速，已成为我国水产养 殖重要支柱产业之一。但随着河蟹养殖规模的不断扩大，病害问题日趋严重，在河蟹众 多病害中，颤抖病是最为常见、危害最严重的一种。此外，近年来，随着虾类养殖业的迅 猛发展，也相继出现了重大的病害。这些重大疾病给经济水产甲壳类的养殖业带来重 创，威胁我国水产养殖业可持续发展。而目前，当一些病害发生时，由于没有确定病原， 因而缺乏科学的对症预防和治疗措施，许多养殖户只有盲目用药，这样不仅药物污染了 水源，给水产业的可持续发展带来障碍，而且许多药物通过食物链积累，潜在地威胁人 类的健康和生存。所以当前迫切需要解决的问题是尽快明确致病因子，进而制定科学 有效的防治措施，以便控制疾病的发生和发展。 我们先前对河蟹颤抖病的病因进行了探索性的研究，开展了病理学、病原学、流行 病学的研究，发现类立克次体生物(Rickettsia—like organisms，简称RLO)是颤抖病的 致病体，用鸡胚培养、分离、纯化了病原并完成了柯赫氏法则(Koch’sRule)验证。在此 基础上，为了进一步确认病原体的分类地位和致病机制，运用国际公认的细菌系统分类 “金标准”16S rRNA基因序列分析技术，对分离纯化的和被侵染组织的颤抖病病原体． 进行16S rRNA基因序列检测和分析，发现该病原体并非属于先前认为的类立克次体 生物(这一最初判断主要建立在形态学基础上)，而是一种螺原体类微生物。这是国际 上除植物和昆虫以外在水生甲壳类动物发现的一种新型病原微生物。因为自30多年 前首次在植物和昆虫体内发现螺原体类微生物以来，这种微生物的寄主始终被认为只 有植物和昆虫，所以无论从寄主种类还是从分布范围来说，水生动物螺原体都是一个特 例，而螺原体又是微生物中一个非常独特的种类，它们具有典型的螺旋形态和运动能 力，无细胞壁，有滤过性，能在人工培养基上生长等特征，因此要确定颤抖病病原是螺原 体类微生物，除了分子生物学的证据外，还需进行形态学、细胞生物学和微生物学的验 证。此外，运用这些技术对近期流行的虾类重大疾病开展了研究，发现这些病也与螺原 2007年中国微生物学会学术年会 33 体病原微生物有关，说明螺原体病原已在水生甲壳动物间进行了广泛传播，应当引起高 度重视并开展深入研究。 。 1．材料和方法 1．1 材料来源 患颤抖病的蟹于分别取自江苏的六合、宝应、淮阴和安徽天长、全椒等地区的13个 养殖塘。前后共取病蟹102只，体重30—1009。正常蟹取自未发生过颤抖病的江苏苏 州东山和南京市高淳县等养殖地。还有一部分来自市场采购，体重35—759，共计 107只。 克氏原螫虾Procambarusclarkii的病虾来自安徽全椒、江苏高淳的3个河蟹养殖 van． 塘，而且这些养殖塘河蟹曾发生过颤抖病。患暴发流行病的南美白对虾Penaeus namei来自江苏宝应2个养殖户的养殖塘。 正常河蟹、克氏原螫虾、南美白对虾购自市场，实验前均进行血淋巴细胞光镜快速 检测，筛选健康个体作为对照组个体。 1．2病原微生物的分离、培养 1．2．1从病蟹血液分离 活体病蟹第三步足基部75％酒精局部消毒，无菌注射器(1mL)抽取蟹血0．5mL， 与0．5mLPBS混匀，用孔径为220nm滤器过滤，取5“1滤液负染，电镜观察