生物工艺原理（ 第二版） 教学课件 作者 贺小贤 主编 课件 工艺原理（ 第八章）.ppt

尚辅网 尚辅网 第八章 基因工程菌的发酵 基因工程菌（genetically engineered microorganism） 以微生物为操作对象，通过基因工程技术获得的表达外源基因或过量表达或抑 制表达自身基因的工程生物，包括细 菌、放线菌等原核细胞微生物和酵母 、丝状真菌等真核细胞微生物。 8.1 基因工程菌表达系统的种类与特征 芽孢杆菌系统 酵母系统 链霉菌系统 丝状真菌系统 重组DNA分子的转化 Ca+诱导的转化： CaCl2溶液处理过的大肠杆菌 能够吸收?噬菌体DNA。 PEG介导的细菌原生质体转化：含有适量溶菌酶的等渗 缓冲液处理细菌细胞，有 利于双链环状DNA的吸收。 电穿孔转化：电场介导的细胞膜可渗透化技术。 接合转化：同一细胞中含有带接合功能区域的辅助质粒，则可 帮助载体质粒接合转化到受体细胞。 转染：利用噬菌体或病毒的感染，把外源基因导入受体细胞。 重组子的筛选与鉴定 载体遗传标记的筛选 抗生素抗性筛选： 营养缺陷型筛选： ?-互补筛选： 噬菌斑筛选法： 目标基因序列的检测 菌落原位杂交： 限制性酶切图谱分析： DNA的序列测定： 目标基因表达产物的检测 外源基因表达产物的检测 产物检测对工程菌的取舍具有决定性的作用，只有正确、高效表达目标基因的细胞才能用于工业化生产。 目标基因克隆在表达载体上，它具有在受体细胞中发挥功能的表达控制元件，通过检测这种蛋白质的生物功能或结构来筛选和鉴定重组子。 表达检测也用于蛋白质与蛋白质相互作用的研究和抗体等的筛选中，如噬菌体表面展示、酵母杂交系统。 8.3 基因工程菌的发酵 8.3.1 基因工程菌发酵的物质需求 碳源： 糖类、有机酸、脂类和蛋白质类。使用不同的碳源 对菌体生长和外源基因的表达有较大的影响。 氮源： 用于基因工程菌合成氨基酸、蛋白质、核苷和核酸 及其他含氮物质。基因工程菌可直接很好的吸收利 用无机氮，一般不能利用硝基氮，几乎都能利用有机 氮源。不同工程菌对氮源利用能力差异很大，具有很 高的选择性。 8.3 基因工程菌的发酵 基因工程菌发酵的物质需求 无机盐 包括磷、硫、钾、钙、镁、钠等大量元素和铁、铜 、锌、锰等微量元素，为基因工程菌生长提供必需 的矿物质，对代谢具有重要的调节作用。 生长因子 包括维生素、氨基酸、嘌呤或嘧啶及其衍生物、脂 肪酸等，在胞内起辅酶和辅基作用等，参与电子、基团等的 转移。 由于蛋白胨等天然成分含有各种生长因子，因此一般 在基因工程菌的培养基中不单独添加。 8.3 基因工程菌的发酵 基因工程菌发酵的物质需求 选择标记的成分： 基因工程菌往往是具有营养缺陷或携带选择性标记 基因，这些特性保证了基因工程菌的纯正性和质粒 的稳定性。选择标记有两类，营养缺陷互补标记和 抗生素抗性选择标记，因此在培养基中应添加相应的成分。 接种量： 接种量的大小影响发酵的产量和发酵周期，其大小取决于生 产菌种在发酵过程中的生长繁殖速度。 8.3 基因工程菌的发酵 8.3.2 基因工程菌发酵的环境需求 温度：工程菌生长温度与发酵温度往往不一致，考虑生长速率、发酵速率、产物形成速率。 溶解氧：都是好氧微生物，发酵过程中要充分供氧 pH值：干扰素在酸性稳定，碱性条件降解 渗透压：等渗状态，工程菌正常生长 光线：培养期间要避光，并防止外来辐射发生。 8.3.3 基因工程菌的遗传稳定性 质粒的不稳定性 　①质粒复制的不稳定； 　②质粒分配不稳定； 　③质粒结构的不稳定； 　④培养环境条件引起的质粒不稳定； 质粒复制的不稳定(plasmid replication instability)： 指基因工程菌复制时出现一定比例不含质粒的子代菌的