“生物大分子分离纯化及检测”试题.doc

2005级硕士研究生 “生物大分子分离纯化及检测”试题 专业____________________姓名____________________学号____________________ 一、简述或解释（70分） 1、电渗？逆回效应？肽图？电泳迁移率？（8分） 电渗即电解质在电场中的相对位移。原因：固体支持物与溶液中会形成双电层，在电场作用下会使电解质进行相对位移，我们称之为电渗。电渗与固体支持物本身的性质有关。在对流免疫电泳中利用电渗效应，而在其他电泳中尽量消除电渗作用。 逆回效应：分析样品为血清蛋白时，虽电泳时间的不同，可得到不同的电泳图谱，在20个小时的电泳过程中，分离区带的顺序也会发生变化，称逆回效应。原因：样品中含有电解质，在电泳过程中，由于电解质的存在，样品各成分所带的实际电荷发生改变，从而造成某种成分移动方向的改变，而表现出逆回效应。如果将血清样品先对所用电泳缓冲液进行透析，就不会出现逆回效应，各条区带的移动与时间呈线性关系。 电泳迁移率：在一定电场下，带电质点的迁移速度。U=Q/6hrpai. 2、测定蛋白质等电点方法的基本原理？（6分） 在等电聚焦电泳中，由于载体两性电解质在电场作用下形成PH梯度，加入样品蛋白质以后，由于蛋白质所带电荷的性质及程度不同，在电泳过程中就会向不同的方向（与其带相反电荷的方向）移动，当蛋白质移动到与其等电点相等的PH区域时，由于蛋白质本身所带净电荷为0，故停止移动，因此在电泳结束后蛋白质所在位点的环境PH就是蛋白质的等电点。 3、狭义亲和层析的基本原理？（5分） 狭义亲和层析基本原理：生物大分子之间有一种特异的相互作用，比如：抗原-抗体、酶-底物、配体-受体等等。将其任何一方固定来分离纯化另一方（通过特异相互作用结合，改变环境条件使分离纯化成分解离）。 4、离子交换层析的洗脱方法及方式？（6分） 离子交换层析的洗脱方法：⑴、改变起始缓冲液的PH，是牢固吸附状态的组份变为有限吸附状态或完全解吸状态。⑵、增加起始缓冲液的离子强度（加中性盐、缓冲盐等），以增加洗脱液的洗脱能力。⑶、改变起始缓冲液PH的同时，增加其离子强度，以增加洗脱液的洗脱能力。 5、对流免疫电泳基本原理？（5分） 对流免疫电泳的基本原理：环境的PH为免疫球蛋白的PH左右，但由于琼脂糖凝胶作为介质，产生电渗作用。使抗原在电场中移动的同时，由于受到电渗作用的影响，本不移动抗体在介质中发生与抗原的相向移动。 6、电泳结果检测时，单纯蛋白的三种染料、糖蛋白的一种染料、脂蛋白的两种染料？（3分） 在电泳结果检测时，单纯蛋白的三种染料：萘黑12B、苯胺黑、溴酚蓝、丽春红，糖蛋白的一种燃料：schiff’s试剂，脂蛋白的两种种染料：苏丹黑B、油溶红O。 7、测定蛋白质分子量的四种方法？（4分）用于测定蛋白质分子量测量的的两种方法(层析和电泳)的基本原理？ 测定蛋白质分子量的四种方法：葡聚糖凝胶层析、SDS（聚丙烯酰胺凝胶）电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、琼脂糖凝胶层析、聚丙烯酰胺凝胶层析。 8、疏水层析和反相层析的异同点？（8分） 疏水层析：以C8、苯、C4等烃链作为功能基团共价偶联到水不溶性载体上而制得的亲和层析填料，利用生物分子表面疏水性的强弱差异而分离纯化的方法。反相层析：一般以水以及与水互溶的有机溶剂作为流动相，流动相的极性大于固定相的极性。在反相层析中，在洗脱液中加入一些与与分离组分带相反电荷的离子试剂，这些离子试剂与欲分离纯化组分结合后使其总的亲水性增加或是疏水性增加。相同点:流动相极性大于固定相极性。不同点：一、固定相的非极性，反相层析大于疏水层析；二、洗脱液反相层析用的是水或与水互溶的有机溶剂，而疏水层析用的是中性盐。 9、凝胶层析的基本原理？凝胶层析的组别分离、分级分离？两者最大上样量？（7分） 凝胶层析的基本原理：分子筛效应，用具有一定孔径的多孔凝胶作为支持物，例如交联葡聚糖凝胶及其衍生物、琼脂糖凝胶及其衍生物、聚丙烯酰胺凝胶及其衍生物等，以水溶液作为流动相，依据分离组分的分子量大小不同而使其相继被洗脱下来。 凝胶层析的组别分离：A、将大分子与小分子分离，原则：是大分子处于完全排阻状态。B、样品脱盐，由于样品中盐对实验的干扰，使组分处于全排阻状态脱盐。C、电泳或离子交换时溶剂交换。分级分离：样品中含有很多组分，分子量之间有一定的差异，但又达不到组别分离，试验的目的是将其分离。选用排阻限度略大于样品中最高分子量组分的凝胶，在层析过程中，组分能不同程度的渗透到凝胶内部，由于分配系数kd的不同，最后可能得到分离（kd达到分离要求）。 两者最大上样量：组别分离，上样体积为柱床体积Vt的25﹪-30﹪，分级分离上样体积为 柱床体积的1﹪-4﹪。 10、聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理、用途、优点？（10分） 聚丙烯酰胺凝胶电泳的基