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长效TFPI突变体的分子设计及性质研究 白浩，孔德升，郭泓坤，林伊风，彭卓醇，蔡旭，张农，马端t (复旦大学分子医学教育部重点实验室，上海200032) 【摘要]组织因子途径抑制物(TissueFactor Pathway 物，具有抗凝和抗炎的双重作用，对重度败血症、感染性休克／DIC等疾病具有明显的治疗作用。但其半衰 后进入细胞代谢。根据TFPI与其受体相互作用的特性及其分子结构特征，本研究利用计算机辅助技术． TFPI．Mut4在大鼠体内的分布相半衰期tln。分别延长1．33倍和1．96倍，消除相半衰期tl／2B分别延长1．62 倍和4-22倍，实验结果与计算机模拟相符，达到了保持活性，延长丰衰期的目的，为进一步的药效学研究 奠定了基础。 [关键词]TFPI，突变体，半衰期，药代动力学 Factor 组织因子途径抑制物(7FissuePathway 使用时间长(至少连续使用96小时)。如此大剂量连续使用，不但临床用药不便，而且患者经济负担沉重。 因此，延长重组TFPl的半衰期是目前亟待解决的问题。 TFPl主要通过K3和C末端与肝细胞表面受体LRP结合后进入细胞代谢，静电引力在两 者结合时发挥主要作用。我们应用蛋白质结构生物学原理，在计算机工作站上对K3和C末端进行同 酸进行分男1j突变后，计算机模拟显示突变体与受体LRP的结合能力明显下降。表达复性后的突变体保持了 与野生型TFPI相似的抗凝活性，但半衰期得到了明显的延长。本实验为进一步的临床前研究打下了基础。 1材料和方法 l-1菌种与质粒 构建。 1．2试剂 FF、SP FF购自 蛋白质定量检测试剂盒购自Bio．Rad公司；离子交换树脂QSepharoseSepharose Amersham FXa购自ADI公司；凝血活酶购自 Biosciences公司；人凝血因子FXa、发色底物Spectrozyme 物中心。 Tel：021 +通讯作者：马端，男，博上，教授。E-mall：．duanma@,shmu．edu．cn 国家自然科学基金(N和上海市重点科技攻关课题基金(No．034319205)资助。 20l 白浩．男，博士，1972年8月出生。 1．3长效TFPl分子设计 TFPI的K3结构域和LRP的C3亚结构域的空间结构已经被解析，在SGl02计算机工作站上，以TFP! 的K3空间结构为基础，应用Insight II软件包进行K3+C末端分子同源模建，C末端包含碱性氨基酸集中 分子，未发现任何氨基酸残基；以2．5埃为半径搜索，仅发现K254单个氨基酸残基；以3．0埃为半径搜索， 部突变为Ala，命名为TFPI-Mut4。对比突变前后配体．受体复合物空间结构和能量变化。 PCR方法和Gene 以表达质粒pET-28a(+)一TFPI为模板，分别用Megaprimer SOEing【GeneSplicingby Overlap pET-28a(+)-TFPI-Mut4。 1．5重组TFPI-Mutl和TFPI-Mut4的表达、纯化 布LBK平板。挑单克隆菌落接种至2mL LBK(1％Tryptone，0．5％Yeast Kan)培养液中，37。C，250r／rain培养至OD600=2．0，50倍放大接种至100mLLBK培养液中，继续培养至 OD600=2．0，接种至4L 加ImoI／L IPTG至终浓度o．5mmol／L，诱导表达3h。 分析纯度。分装，冷冻干燥，．70℃保存。 1．6抗凝活