我国片形吸虫线粒体基因组部分序列多态性地研究.pdfVIP

2004学术年会囝1057 我国片形吸虫线粒体基因组部分序列多态性的研究 董世娟1～，朱兴全”，黄维义2，林瑞庆1，钱德兴3，宋慧群1 防疫检疫总站，贵州贵阳550000 摘要：用Y33P对引物进行标记，对76株片形吸虫的线粒体基因组细胞色素氧化酶亚基1基因部分 测序结果显示我国片形吸虫pcoxl序列和pnadl序列均种内变异不明显，种间变异显著，两段基因的测 序结果互相支持。表明coxl序列和nadl序列可以作为片形吸虫种内和种间遗传多态性研究的标记。 关键词：片形吸虫；coxl；nadl；PCR—SSCP,多态性 片形吸虫是一种危害牛羊等反刍兽和人类的寄生性蠕虫，呈世界范围分布，该虫引起的疾病在 全球每年造成约20亿美元的经济损失。在我国，片形吸虫常见的两个种是肝片吸虫和大片吸虫。两 个虫种形态极其相似，但在虫体抗原性、免疫原性、对宿主的致病性、对药物的敏感性等方面均存 在差异。到目前为止，人们对两个虫种的致病性及免疫机理等方面的差异仍知之甚少。随着科技的 不断进步，分子遗传学分析为片形吸虫的遗传变异及分类学研究提供了新的途径，从基因水平上反 映虫种的遗传信息可以明确片形吸虫的遗传变异水平。单链构象多态性分析(SSCP)是一种简便、 灵敏的基因突变检测方法，是学者们研究遗传变异水平常采用的方法，也是测序前筛选大量样品的 列分析技术研究我国不同地区片形吸虫pcoxl和pnadl的多态性，并用法国奶牛源的肝片吸虫样品 做对照样本，代表性样品的测序结果和国外已发表的肝片吸虫、大片吸虫的pcoxl序列和pnadl序 列做对比，旨在明确我国片形吸虫种内及种间coxl序列和nadl序列的变异水平。 1材料与方法 1．1虫体样品 虫体的采集地分别是广西、四川、甘肃、南京、贵州、黑龙江等地。根据片形吸虫的肩部、肠分支及 体长与体宽比等形态学特点和片形吸虫的分布特点，对各地的片形吸虫进行初步分类并按字母命名。法国 的肝片吸虫是用法国奶牛源的肝片吸虫的囊蚴感染广西的山羊得到的成虫，样品的详细资料如表1所示。 表1本项研究中所用片形吸虫样品的来源 2004学术年会 1_2主要试剂 System为Promega公司产品， Taq酶、T4连接酶、pGEM—TEasyVector、WizardDNAClean—up 1．3样品gDNA的制备 100mM； 将单个虫体用蒸馏水反复冲洗后，取～半的虫体剪碎，加300pL消化液，其中NaCl 59m。置于37℃恒温培养箱中， 10raM；EDTA(pH=8∞25mM：1％SDS；ProteinaseK Tris-HCl(pH=8．01 经过夜充分消化后，将消化好的虫体悬液用WizardTMClean—up Sysmm试剂盒提取DNA，于一20。C保存。 1．4 PC只扩增 AAGA Buffer 9C变性30sec、55。C退火30sec、726C延伸30sec， 模板DNAlgL。扩增条件为94。C预变性5min，然后94 观察并记录结果。 1．5 PCR—SSCP分析 燥(40～60min)；干燥好的凝胶放于暗盒中，于暗室放入x光片，曝光48—64h后冲片，观察结果。 1．6序列分析 因SSCP电泳图中样品带型的不同，选择各个地区的代表性样品进行PCR扩增，用DNA胶回收试剂盒纯 化PCR产物，然后连接到pGEM-TEasy载体上，再将连接产物转化至大肠杆菌DH5a中，经筛选得到阳 性克隆，将经PCR及酶切鉴定为阳性克隆的菌液送上海联合基因生物技术公司进行测序。两段基因得到 中已发表的片形吸虫pcoxl序列和pnadl序列进行