基于皱皮软海绵宏基因组的PKS基因筛选地研究.pdfVIP

正宁．土噍 套国晦洱生曲杖术与峪再焉曲学术套议论文毒 2006．8．2-6 在该突变株中的表达量得到了显著提高。进一步调整培养基中的磷酸浓度，使得达托霉素异源表达量 从最初约20mg／L增加到50mg／L，且达托霉索的分离提纯方法大大的得到了简化。 基于皱皮软海绵宏基因组的PKS基因筛选的研究 张戌升李志勇。缪晓玲 上海交通大学生命科学技术学院海洋生物技术实验室200240上海 Tel：021E-mail：zyli@sjtu．edu．cn 摘要：提取皱皮软海绵及其共附生微生物的宏基因组DNA，使用聚酮舍酶(PKS)基因的酮酰合酶 段克隆到大肠杆菌中，从阳性克隆中分离出PKS基固片段。测序推导出氨基酸序列。通过BLAST比 bacterium 对发现此氨基酸序列与红细菌目的RhodobaeteralesPKS基因KS域的氨基酸序列有96％的 同源性．通过基于氨基酸序列的系统发育分析，推测此筛选得到的PKS基因属于trans-AT型。本文 首次证实了皱皮软海绵中存在细菌来源的PKS基因，这对于证明海绵活性物质微生物来源假说提供 了有力证据。同时，本文也为夸后从基因水平利用尚不可分离培养的海绵共生微生物资源提供了基础． 关键词：皱皮软海绵，宏基因组，聚酮舍酶基因，PCR扩增，序列分析 海绵约占海洋物种总量的1／15，是海洋中除珊瑚外的第二大生物量，全世界大约有10000到15000 种左右，我国据称也有5000种左右。国外研究表明，海绵中存在许多结构新颖的活性物质，大多在 陆地生物中从未发现过，而且很多物质具有广谱的抗菌、抗肿瘤、抗病毒、降血压、凝血和溶血等生 物活性，是潜在的新药来源【1叫。但是绝大多数海绵活性物质的来源至今还是个谜．几乎全部的海绵 活性物质还没有实现大规模制备，前者是后者的主要限制性因素。目前开展海绵及其共附生微生物功 能基因的研究代表了海洋生物技术的前沿热点，这方面的研究将有助于为解决海洋活性物质制备的瓶 颈问题找到一条途径。 聚酮(polyketide)是一类结构多样且具备多种生物学活性的次生代谢产物，被广泛用作抗生素、 免疫抑制荆、抗癌药”J。目前已有较多针对海绵及其共附生微生物中聚酮化合物的研究，例如：Abrell 等从印度尼西亚海绵中分离得到产生聚酮化合物的真菌161，Bugni等从斐济海绵中得到的细菌的发酵 液中分离得到新结构的聚酮化台物17l。相对于从海绵中分离得到聚酮化合物，针对聚酮合酶基因的研 究最近才刚刚开始降…。 我们于2005年成功构建成功了澳大利亚厚皮海绵的Fosmid宏基因组文库，并在此基础上进行 了海绵抗苗肽功能基因筛选的研究…J．这是国际上第一次尝试进行这项I：作。目前上海交通大学已经 在海绵及其共生微生物的功能基因研究方面进行了一些探索性的工作．并已经得到了可喜的进展。 目前，国际上对于皱皮软海绵的聚酮类化合物和相关基因的研究还没育任何报道。本文从皱皮 软海绵宏基因组总DNA出发，利用PCR技术对聚酮合酶基因进行筛选，希望为海绵活性物质来源提 供分子证据，从而为从基因水平开发利Hj海绵资源，为解决海绵活性物质的制备提供可行途径。 1材料与方法 1．I海绵样品 670 4亨·土t 全d辱肆t糖技术童辱耳番●学术奎议卺文毒 2006．8．2-6 皱皮软海绵Halichondria 国科学院海洋研究所李锦和研究员鉴定。 1．。2原材科的处理 用无菌手术刀切取海绵内部及外部组织少许．装入加有适量无菌无钙镁人工海水(CMFSW-31．69 1 7．O)的5ml离心管中t NaCI、O．759KCI、1．ogMgS04、2．49Iris·HCI、20mMEDTA、H20L’pH 用大口径枪头稍加搅动，并适当吹打；用无菌钝头镊子撕成lmm3的小块，于CMFSW中悬浮，用大 2rain．将上层细胞悬液转移至另一无菌5ml离心管中，使用血细胞计数法对海绵细胞及共附生微生