加替沙星体外抗生素后效应期间大肠埃希菌形态学变化的探究.pdfVIP

·6l· 加替沙星体外抗生素后效应期间大肠埃希菌形态学变化研究 王睿朱曼张永青梁蓓蓓 1MIC在0、 抗生幕后效应(Postantiblofie鲋ect，PAE)指细菌与抗生长度分别为：空白对照组2．加±0．57pro，GTLX 素短暂接触，当药物清除后，细菌生长仍然受到持续抑制的效 45h的长度分别为10．25士0．46、 应口】．已成为为评价抗菌药物药效动力学的重要参数。但关 30vm，GTLX4MIC在0…I 于PAE机理尚未完全阐明。加替沙星是新一代氟喹诺酮类 抗菌药物。对G菌和G，菌均有明显的PA辟引。本研究拟应长，各时间点的菌量随之相应增加、菌体长度缩短，但经单因 素方差分析，GTLXlMIC和GTLX4MIC各时间点的E．mli 用原子力显微镜(atomic梳emicttmopy，ArM)观察加替沙 星对E．cdIATO瑚922PAE期间菌体形态学动态变化，同时长度与空白对照组相比均有统计学差异(P0．05)。随着加 应用流式细胞仪和荧光探针技术测定其胞内DNA含量变 替沙星浓度由1MIC增至4MIC，同一时间点内菌量减少、菌 化，为探讨PAR机理提供相关的实验依据。 体长度增加。 一、实验材料：1．抗菌药物与试剂：加替沙星(G弧Ⅸ，含 量：77．9％，批号：00—66，中国药品生物制品检定所)；碘化丙 啶(PI，批号：0000036217，美国Pb日nnjn舯公司)； MH肉汤和琼脂(美国DIFCO公司)。 2．受试菌：E．coliAm=c25922。 3．实验仪器：SPM-9500J3型原子力显微镜(日本岛津公 Cahlour型流式细胞仪(美国BectonDickimlon公 司)；FACS 司)。 二、实验方法 1．实验分组：GTLX(1、4MIc)组、空白对照组。 2．最低抑菌浓度(~ⅡC)测定[，]：采用试管=倍稀释法。 3．PAE测定【4】：采用反复冲洗法清除抗菌药物。以菌落 计数法测定PAE。 4．AFM样本收集及观察口】：于清除药物即捌(0)、1,4．5h 分别吸取45Inl的培养液入50d的无菌离心管，100009，离心 10min，弃上清，将收集的细菌样本重新悬浮于lmlMH肉汤， 田1．空白对照组E．coilAFM围(7．50x7．50vm} 4000tpm离心10min．弃上清，于0．4ml的2％戊二醛中4V固 (图中淡黄色的杆状体为未经药物作用的E．ooli。平均菌 定。 体长度为2．10士0．571an，大小在正常范围内。密度较为均一) 弃去样本中的2％院二醛，用0．2ml双燕水重溶，使细菌 悬浮于双燕水中。吸取少量细菌悬液，小心滴于云母片上，待 水分自然风干，上机检测。扫描方式为接触式，扫描针尖为 刚针尖，图象采集为恒力模式，所有图像均通过自动平滑 处理以消除慢扫方向的低频噪音。 5．FCM样本固定与染色【6J：于清除药物即刻(0)、0．33、 5 0．58、0．83…13，0、4．5,6．0h．分别吸取培养液0．1ml，置于 2％甲醛0．5ml中4C过夜。6000rpm离心10min，弃上清，用 0．05IIll。避光 生理盐水离心洗1次．加入S0mg·I，1的P1 37℃染色15min后加入0．9％氯化钠溶液0．4m[．2h内上机 检测。调节至氩离子激光器激发波长488nm，荧光通道2(波 长605rim)检测Pl的荧光强度，厨值调整刊小于细菌颗粒 的数值，每次获取5000～10000个细菌。 三、实验结果 1．PAE实验结果：GTLXlMIG4MIC与E．∞u ATCC25922作用1h的PAE分别为1．12和2．37h0 2．AFM实验结果：图1为未经药物作用的E础