马氏珠母贝精子低温保存主要影响因素地研究.pdfVIP

福建疆n。 第三届海洋生物高技术论坛 2005．08．19-23 马氏珠母贝精子低温保存主要影响因素的研究 余祥勇4，王梅芳，陈钢荣，刘雅靖，张春芳 (湛江海洋大学珍珠研究所，广东湛江524025) 摘要：采用二甲基亚砜(DMso)和甘油作为抗冻剂，配制体积分数为6、8、10和12％的抗 冻保护液。将马氏珠母贝精液和抗冻保护液以1：2、1：5、1：10和1：20体积比混合后，置4℃ 结果表明，抗冻剂种类、体积分数以及精液与保护液体积比对精子的活动状态有着很大的影 响；4C的平衡时间对精子的存活率影响不显著，但对受精率却有明显的影响。在一18℃时， 精液和抗冻保护液体积比1：20，DMSO体积分数为10％和12％的两组保存效果较好，结果 还显示精子存活率随着保存时间的增长而降低，但基础液的类型对精子受精率没有明显影响。 关键词：马氏珠母贝 精子低温保存影响因子 白1949年英国的Polge等成功地利用甘汕冷冻保存动物精子以来，乙一醇(EG)、丙二 0C 醇、■甲基亚砜(DMsO)等相继被发现有很好的防精子冻伤效果【lJ。动物精予在0℃到4 低湍保存最多只有几十天的时问，而置于一196。C的液氮中，保存数月至数年后解冻，其受 精能力仍能恢复【2】。目前贝类种质低温保存研究则刚刚起步，国内在贝类精液冷冻保存方面 所做的T作较少【3。】。马氏珠埘贝是我国海水珍珠生产最主要的物种，其良种选育T作已取 得一些进展【6q]，本文就马氏珍珠贝精液低温冷冻保存的基础液、2种常用抗冻剂(_二甲基 驱砜和甘汕)的合适浓度及对精子活动和受精的影响、精子与抗冻保护液适宜比例等进行摸 索，考虑到海水养殖场大多偏远而不便使用液氮，故在普通冰箱所能达到4℃和一18℃两个 温度下，对精子冷冻保存影响因素开展研究，以期为日后超低温保存的工作提供基础资料。 1材料与方法 1．1材料 马氏珠母贝取自湛江海洋大学流沙珍珠基地，在实验室暂养备用。剖开后收集外套液置 、r．4C保存备用，并选择成熟饱满的雄贝，从性腺吸取精液用于试验。 1．2基础液和不同体积分数抗冻剂的配制 所用基础液3种：a、海水：b、外套液；C、外套液与海水1：1(体积比)的混合液。抗 冻剂为_甲基弧砜(DMSO)和甘油，用3种基础液分别配制体积分数为6％、8％、10％和 12％的DMSO及甘油抗冻保护液，置4C预冷备用。 1．3不同稀释倍数的精液样品制备 从雄贝性腺取少最精子经氨海水刺激后镜检，选择精子活力好的精液与抗冻保护液按 1：2，1：5、1：10、和1：20的体积比稀释，作为试验组样品；对照组中，精液用不含抗冻剂的 +国家海洋“863”项目(2002AA603022)，E．mail：yuxyong@tom．com 192 谊毽霞门 第三届毒洋生物高技术论坛 200s．08．19-23 海水按1：20稀释。稀释样品摇匀后，分别分装于1．5mL的塑料冻存管中，lmL／管。 1．4抗冻剂的毒性与保护效应估测 将试验组和对照组(未加抗冻剂)样品分两大组(每组平行重复3次)，第1大组_】二4C 冻4h、24h、72h。 1．5解冻及解冻后精子活力的检测 经过．18。C冷冻，取出后马上在35C水浴中解冻，取少许精液，滴加氨海水激活，依据 精子的活动情况估计精子存活率(观察3～5个视野取平均值)。有精子存活的组别用常规方 法受精，观察胚胎发育，在2h后计算受精率。 2结果与分析 2．1抗冻剂种类及精液稀释倍数对保存效果的影响 的抗冻剂、不同的稀释倍数对精子的保存效果有明显差异，结果见表1。 表1 两种抗冻剂及精液稀释对保存效果的影响1’ Table1．TheeffectofthesortSofantifreezeanddiluteratioof onconservation sperm 精液：保护液DMSO体积分数／％ 甘油体积分数／％