酵母蔗糖酶提取方法地研究.pdfVIP

酵母蔗糖酶提取方法的研究 安徽农业大学生命科学学院 李倩 陶芳 摘要：采用自溶法从酵母中提取蔗糖酶，通过抽提、30％乙醇分级、50％乙醇分级和透析，同时测定各步 的蛋白质浓度和酶活，并据此计算比活、回收率和纯化倍数。 关键词：蔗糖酶；提取；自溶法 ResearchontheExtractionMethodofYeast Sucrose SchoolofLifeSciences, BiologicalSciencesofgrade2, liQian Abstract:Theautolysisextractfromyeastinvertase,throughextraction,30 ethanolfractionationanddialysis,simultaneousdeterminationofeachstepofconcertrationof proteinandenzymeavtivity,andthencalculatetheradiooflive,recoveryandpurification. Keywords:yeast;extraction;autolysismethod 将59酵母粉倒入500m1烧杯中、少量多次地加入15m1蒸馏水，搅拌均匀，成 糊状后加入O．59乙酸钠、8m1乙酸乙酯，搅匀，再于35℃恒温水浴中搅拌30min。 的上清液即为粗制酶液。 1．2．2葡萄糖标准曲线的制作 在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度成一定比例关系，可用于比色 测定。采用DNS比色法测定还原糖的含量，同时可测定酶活。 取葡萄糖标准品，用缓冲液配置成一定梯度浓度的溶液，与DNS显色后在 520nm测定吸光值。 表1 葡萄糖浓度标准曲线的制作 以葡萄糖含量(mg)为横坐标、吸光值为纵坐标，绘制标准曲线，获得的葡 萄糖标准曲线回归方程为：y=O．0746x+0．0024。 1．2．3蛋白质标准曲线的制定 采用考马斯亮蓝G一250染色法测定蛋白质浓度。 取标准牛血清蛋白，用生理盐水配置一定梯度浓度的系列标准蛋白液，与 G一250作用后在595nm测定吸光值。 表2 蛋白质定量测定标准曲线制作 轻轻摇匀，5min后以0号管调空白，595nm分光光度法测光密度值，汇出 标准曲线。 未知样品从标准曲线上查出相应浓度经测定，得以蛋白质含量(mg)为横坐标、 吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。获得的蛋白质曲线方程为：y=7．945x+0．0019． 59 从上述公式可知，吸光值和蛋白质含量呈正相关。 表3蛋白质含量与光密度值测定结果 1．2．4蛋白质浓度测定 从留样中取O．3ml加0．9％的Nacl稀释至3ml，再按以下表格操作测定 表4蛋白质浓度0D值 1．2．5蔗糖酶活的测定 取5％的蔗糖、酶液5m1分别于35℃水浴中预热5min[若酶浓度过高，用 0．02mol／l的醋酸缓冲液(PH=4．7)适当稀释]． 表6蔗糖酶水解蔗糖 试管 O l 5％蔗糖 2 2 l∞l／lNAOH(皿1) O．5 酶液(Ⅲ1) 2 2 35℃水浴，3-in l肿l／lNA咖(n1) 襄7还原糖的测定 试管 O 2 反应液(m1) 0．5