绿色荧光蛋白在基因传染中作为标记物应用的前期的探究.pdfVIP

绿色荧光蛋自在基因传染中作为标记物应用的前期研究 管世鹤全家妩(武汉生物制品研究所430060) 【摘要】近年来，随水母Aeqttora v／aor／a来源的绿色荧光蛋白(雕氍nflurescentprotein．GFP)，由238个氨基酸组 成．稳定发蓝、绿色荧光，GFP作为一种新型的报道蛋白在生物学界引起了广泛的关注，它已吸引了从生命科学(包 括细胞生物学、分子生物学、发育生物学、遗传学及生物技术等)到生物医学及农学许多领域研究者的兴趣。 为了探讨绿色荧光蛋白在真核细胞中的表达及其毒性问题，本文将这种真核表达载体质粒pEGFPt／CMV分别 转染人脑胶质瘤细胞U251、人肝癌细胞Hep3B、人膀胱癌细胞株124和人小细胞肺癌株LTEP-P等几株肿瘤细胞； 另外，还转染人正常细胞——原代地鼠肾细胞以全面了解GFP的表部及其对细胞生长是否有影响——即GFP对细 胞是否具有毒性；并以Hep 细胞中，经台盼蓝染色计数、荧光显微镜观察、M1T检测、吖啶橙染色、LDH检测、琼脂糖凝胶电泳、乙肝}Ⅱ地测定 3B中表达， 等方法来确定GFP对细胞生长和增殖的影响，从而以判断GFP是否具有毒性；结果表明GFP能在Hep 3B没有毒性， 荧光显徽镜下可见明亮的绿色荧光，且表达GFP的细胞生长与增殖均未受到影响；亦即GFP对Hep 有望作为理想的报道蛋白；为今后以GFP作为报道蛋白提供实验基础。 3B毒性 【关奠词】pEGFPL／CMV绿色荧光蛋白GFP脂质体DOTAPHep 来自于AequoreaVictoria水母(Jellyfish)的绿色因此，GFP在现代生物医学上展现出广阔的应用前 fluorescent 荧光蛋白(gIeen protein，GFP)在不加任何景。本研究采用可在真核细胞表达的基因质粒 外源物质及协同因子的情况下吸收蓝光(最大吸收 峰为395nm，次级吸收峰位于470rma)，可以原核和真 别转染人肝癌细胞株Hep3B及人膀胱癌细胞株 核细胞中表达且发绿色荧光(最大发射峰为509nm， 次级发射峰位于540am)…。并且荧光性质很稳定， 株和正常的地鼠肾细胞以了解GFP对多种细胞增 也不发生光致漂白，所发出的绿色荧光用普通荧光 殖的影响、毒性等，为今后以GFP作为报道蛋白提 显微镜或荧光激活细胞分拣仪(FAcs)均可检测到。供实验基础。 GFP作为细胞生物学、发育生物学、生物医学、基因 材料与方法 工程研究上的一种新型的选择标记，具有检测灵敏 度高、操作简便、对细胞毒副作用小等诸多方面的优 1．细胞株、菌株与质粒 点，它已吸引了许多领域研究者的广泛兴趣。近几 1．1细胞株 年来有关其结构、物理、化学、生物、生色基团发光机 3B：由德国国家肿瘤研究所 人肝癌细胞株Hep 理及基因改造等方面已有大量的文献报道。GFP基 ClausH Schroder教授惠赠，该细胞能分泌乙肝病毒 因(sfp)是目前发现的唯一能在细胞表达且不需要 HBsAgo 其他外源底物参与的全新报道基因”J。近几年来关 1．2菌株 于GFP的基本结构、生色基团、发光机理及基因改 大肠杆菌JMl09，质粒的宿主菌，本实验室保 造等均有大量的研报道“2““