基因工程期末复习.docVIP

第一章 基因工程的概念 第一节 基因工程诞生的理论基础 一.确定了遗传信息的携带者是DNA而不是蛋白质。明确了遗传的物质基础问题 1. 肺炎双球菌转化实验 1944年 Avery，确定了基因的分子载体是DNA，而不是蛋白质。 2. 噬菌体转染实验 1952年Alfred Hershy和Marsha Chase进一步证明遗传物质是DNA二.揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机理，解决了基因的自我复制和传递的问题。 1953年James D. Watson和Francis H. C. Crick揭示了DNA分子的双螺旋结构和半保留复制机制。三.提出了“中心法则”和操纵子学说，并成功地破译了遗传密码，从而阐明了遗传信息的流向和表达问题  1958年Crick又提出了遗传信息传递的“中心法则” 1964年Marshall Nirenberg和Gobind Khorana等终于破译了64个遗传密码 F.Jacob和J.Monod在1961年提出了操纵子学说/view/225864.htm第二节 基因工程诞生的技术基础 DNA分子的体外切割与连接 1.限制性内切酶（restriction enzymes） Werner Arber 理论预见限制酶 1968年H.O. Smith等分离出第一种限制性核酸内切酶 Daniel Nathans 用限制酶切得SV40 DNA片断 3人于1978年获得Nobel生理或医学奖2. DNA连接酶（ligase） 1967年5个实验室几乎同时发现了DNA连接酶二. DNA分子的核苷酸序列分析  1975年F. Sanger、A. Maxam和W. Gilbert发明了DNA快速测序技术, 1980年Nobel化学奖三.载体的构建  1972年前后使用小分子量的细菌质粒和?噬菌体作载体。在细菌细胞里的大量扩增四.转化技术  1970年M. Mandel和A. Higa发现经过氯化钙处理的大肠杆菌容易吸收噬菌体DNA。1972年S. Cohen发现这种处理过的细菌同样能吸收质粒DNA五.琼脂糖凝胶电泳和southern转移杂交技术  1960s发明了琼脂糖凝胶电泳，可将不同长度的DNA分离开;DNA印迹技术由Southern于1975创建,称为Southern印迹技术 二.基因工程的定义和特征1.定义 在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子，构建遗传物质的新组合，并使之渗入到原先没有这类分子的寄生细胞内，而能持续稳定地繁殖  在体外对不同生物的遗传物质（基因）进行剪切、重组、连接，然后插入到载体分子中（细菌质粒、病毒或噬菌体DNA)，转入微生物、植物或动物细胞内进行无性繁殖，并表达出基因产物 酶学基础 1 拷贝数就是指某目的基因（可以是质粒）在某一生物群体或个体中存在的个数. 单拷贝就是该基因在基因组中只有一个,多则指有多个。 　　(一)在细菌细胞中，某种特定质粒的数目。根据复制特性，质粒分严紧型和松弛型两类，前者在细胞中只含1～2个，而后者含10～15个以上。恒定的拷贝数与质粒复制控制系统、宿主细胞遗传背景及生长条件有关。质粒复制控制系统首先通过调节复制的起始点来控制拷贝数，调节因素包括阻遏蛋白、反义RNA和某些顺向重复序列。有些质粒还有其他控制系统，如有分配功能的par系统和确保质粒稳定遗传的ccd系统。一旦质粒上与调控有关的基因或位点突变，可使拷贝数明显增加或减少。 　　 (二)。1单位限制性内切酶（1 U）通常定义：在建议使用的Buffer及温度下，在20(l（50(l）反应体系中反应1小时，使1g入DNA完全消化所需的酶量. 星活性（star ctivity） 在非最适的反应条件下，酶的识别特异性降低，产生非特异性带，这种酶切特异性降低的现象，称为星活性。所谓非最适的反应条件：过量酶、低盐浓度、过量甘油、高pH（8.0以上）、有机溶剂ex：酒精（EcoR I对酒精敏感）、SDS、苯酚、氯仿等。 五.影响限制性核酸内切酶活性的因素 1、DNA样品的纯度： 蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等将影响DNA样品的纯度。 如果DNA样品难以纯化时，可以采取下列方法进行酶切： 加大酶的用量，1 mg DNA 用 10U 酶(但是不能超总体积1/10 加大反应总体积 延长反应时间 2、DNA样品的甲基化程度： 核酸内切限制酶是原核生物限制—修饰体系的组成部分，因此识别序列中特定核苷酸的甲基化作用，便会强烈地影响酶的活性。 为避免产生这样