生物化学实验指导 - 大连海洋大学精品课程 - 大连水产学院.docVIP

生物化学实验指导 李 伟 编 大连水产学院 2005目 录 理 论 部 分 一 总论……………………………………………………….5 生化实验技术发展简史…………………………………. 5 实验室规则………………………………………………..6 实验记录及实验报告……………………………………..7 实验室基本操作…………………………………………..8 缓冲液与pH值测定………………………………………9 二 生物大分子制备和检测技术……………………………17 生物大分子的制备……………………………………….17 层析技术………………………………………………….21 电泳技术………………………………………………….30 离心分离技术…………………………………………….32 分光光度技术…………………………………………….34 放射性同位素检测技术………………………………….37 实 验 部 分 第一部分 糖…………………………………………………42 实验一 可溶性糖含量的测定………………………………42 第二部分 蛋白质……………………………………………45 实验二 血清蛋白的盐析及清/球比值的测定……………….45 实验三 凝胶过滤层析………………………………………..49 实验四 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS)…………………54 实验五 蛋白质及肽的N末端氨基酸测定………………….60 第三部分 酶…………………………………………………..65 实验六 乳酸脱氢酶粗提液的制备及活力测定……………..65 实验七 亲和层析纯化乳酸脱氢酶…………………………..69 实验八 碱性磷酸酶的Km值测定…………………………..75 实验九 pH对酶促反应速度的影响…………………………79 实验十 温度对酶促反应速度的影响………………………..82 第三部分 核酸………………………………………………..84 实验十一 动物肝脏RNA的制备及琼脂糖电泳的鉴定……84 实验十二 二苯胺显色法测定DNA的含量…………………89  一 总论 生命科学在20世纪具有惊人的发展，其中生物化学与分子生物学技术的进展尤为迅速，它极大地推动了生命科学的发展，并将成为21世纪带头学科。该学科的发展与实验技术息息相关，每一种新的生化物质的发现与研究都离不开实验技术，实验技术每一次新的发明均大大推动了生物化学研究的进展，因此，实验部分在生物化学这门学科学习中占有重要地位。它也是生物技术专业学生必修的一门基础实验课程，对于每一位生物技术专业学生来说，学习并掌握各种生物化学实验技术是极为重要的，它在生命科学基础研究领域具有广泛应用价值。 1．生物化学实验技术发展简史 20世纪20年代，微量分析技术的发展和超离心技术的建立，开创了生化物质离心分离的先河，同时，准确测定了如血红蛋白等复杂蛋白质的分子质量。30年代，电子显微镜技术打开了微观世界，使我们能够看到细胞内以及生物大分子的内部结构。40年代至70年代期间，层析技术和电泳技术兴起，以及同位素示踪技术、各种光谱技术应用，尤其是Watson和Crick利用上述技术提出并证实了DNA双螺旋结构模型，这些研究成果开创了生命科学的历史新纪元。20世纪70年代，基因工程技术取得了突破性的进展，Arber、Smith和Nathans 3个小组发现并纯化了限制性内切酶。1972年，美国斯坦福大学的Berg等人首次使用限制性内切酶切割了DNA分子，并实现了DNA分子的重组。第二年，Cohen等人第一次成功进行了DNA重组体的转化技术，与此同时，各种仪器分析手段进一步发展，研制成功了DNA测序仪、DNA合成仪等。从此，生物化学进入了蓬勃发展的时期，即进入了分子生物学时代。1985年，PCR（polymerase chain reaction））”确定即可，标准缓冲液不用时应冷藏。 (6)电极的玻璃泡容易被污染。若测定浓蛋白质溶液的pH值时，玻璃泡表面会覆盖一层蛋白质膜，不易洗净而干扰测定，此时可用0.1 mol/L的HCl和l mg／ml胃蛋白酶溶液浸泡过夜。若被油脂污染，可用丙酮浸泡。若电极保存时间过长，校正数值不准时，可将电极放入2 mol／L的KCI溶液中，40℃加热1 h以上，进行电极活化。 溶液pH值取决于溶液中的离子活度而不是浓度，只有在很稀的溶液中，离子的活度才与其浓度相等。生化实验中经常配制比使用浓度高10倍的“贮液”，使用时再稀释到所需浓度，由于浓度变化很大，溶液pH会有变化，因而，稀释后仍需对其pH进行调整。 有的缓冲液（如“Tris”）的pH值受温度影响很大，所以配制和使用都要在同一温度下进行。  二 生物大分子制备和检测技术 生物大分子是指在生物体内存在的具有特殊生物学功能的高分子化合物，主要